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A revision of the Schoenheimer-Sperry method for cholesterol determination 总被引:128,自引:0,他引:128
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目的:通过克隆LC3.I基因,体外原核表达LC3-I蛋白后制备抗LC3单克隆抗体,作为自噬研究中的标记分子检测自噬的发生和发展过程。方法:RT.PCR方法从RAW264.7细胞基因组中克隆LC3基因,亚克隆至pQE80L原核表达载体后转化E.cobDH5a进行诱导表达,SDS—PAGE电泳及Westemblot鉴定表达蛋白。蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠。采用淋巴细胞杂交瘤技术,制备分泌抗LC3.I杂交瘤细胞株,体内诱生腹水制备mAb,间接ELISA法测定其效价,辛酸一硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化mAb。结果:成功克隆了LC3一I基因,并对其在E.coilDH5a进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明在相对分子量Mr为20×10^3有特异条带,Westernblot验证表达产物具有一定的生物学活性。建立了3株稳定分泌特异性抗LC3-ImAb的杂交瘤细胞株,诱导产生的腹水获得的抗体效价在10^5-10^7之间,结论:在E.coli中对LC3-I进行表达,并制备特异性较强抗LC3-I蛋白的单克隆抗体。为自噬研究提供了良好的标记分子,可对自噬形成和发展进行有效的检测。 相似文献
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甲基化修饰是蛋白翻译后修饰的主要方式之一。真菌中,多种赖氨酸甲基转移酶能够执行组蛋白特定位点上赖氨酸的甲基化。组蛋白上赖氨酸的甲基化与真菌DNA的复制、转录以及异染色质的形成相关。甲基化参与了多种生物学过程,如真菌发育、昼夜节律调节、次级代谢基因簇表达、水解酶合成、致病真菌毒力形成。本文结合笔者工作,对目前真菌中已经发现的组蛋白赖氨酸甲基转移酶的命名、分类、结构域特征、催化域的三维结构以及它们所执行的甲基化在各种真菌中的作用进行了总结,提出了目前研究的不足并对未来的研究方向和内容进行了展望。 相似文献
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真菌漆酶(laccase)是一种多酚氧化酶,在真菌生长发育中具有重要作用。本研究采用根癌农杆菌介导转化的方法,以香菇Lentinula edodes菌株W1为受体菌株,在Leactin基因启动子调控下过表达Lelcc1基因;对其中7个单拷贝插入的转化子进行qRT-PCR分析,7个Lelcc1基因表达量较出发菌株W1均上调了1.5-8倍。进一步分析了这7个转化子的遗传稳定性;挑取了3个稳定的转化子进行表型分析,主要包括不同培养基中的生长速度、代料栽培过程中菌棒转色程度、以及透射电镜观察菌丝细胞的超微结构。发现转化子和受体菌株W1的生长速度无显著差异,但代料栽培过程中转化子较W1转色更快,菌棒表面颜色更深;透射电镜观察菌丝细胞的超微结构发现在细胞壁厚度、细胞膜形态等方面,其中两个超量表达转化子与W1间存在显著差异。结果表明,香菇Lelcc1基因可能参与了转色过程中色素合成或积累,也可能与细胞壁形成有关。 相似文献
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摘要:目的 探讨屎肠球菌的万古霉素替考拉宁A型抗性蛋白/D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶(Vancomycin Teicoplanin A-type resistance protein D-alanine-D-alanine ligase,vanA)调控人正常结直肠黏膜细胞FHC凋亡的机制。方法 在人正常结直肠黏膜细胞FHC中使用屎肠球菌感染,Annxin-V染色检测细胞凋亡情况。使用屎肠球菌的VanA蛋白刺激,检测FHC细胞凋亡情况、ROS水平以及ROS标志蛋白MDA、GSH和SOD的表达水平。ROS抑制Acetylcysteine处理VanA刺激的FHC细胞后,检测细胞凋亡相关蛋白的表达水平。结果 屎肠球菌与人正常结直肠黏膜细胞FHC共培养后,人正常结直肠黏膜细胞FHC的凋亡水平明显升高(t=2.876,P=0.045 2),并且VanA蛋白能促进FHC凋亡水平(t=5.579,P=0.005 1),同时细胞凋亡相关蛋白CLEAVED-CAS9、BAK的表达量上升,BCL-2的表达量下降。屎肠球菌的VanA蛋白刺激后,发现正常结直肠黏膜细胞FHC的ROS水平上升(t=10.190,P=0.000 5),ROS标志蛋白MDA(t=4.315,P=0.012 5)和SOD(t=5.751,P=0.004 5)的表达水平上升,GSH(t=5.225,P=0.006 4)的表达水平下降,但是,ROS抑制剂Acetylcysteine能够抑制这种现象。结论 屎肠球菌的VanA通过提高细胞内ROS水平来促进人正常结直肠黏膜细胞FHC凋亡。 相似文献