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921.
目的: 核糖体蛋白(RPs)属于多功能蛋白,能够参与调控细胞生长和响应胁迫条件。RpRPL22是一个从豆科植物刺槐中分离得到的结瘤相关基因,通过序列比对发现其与核糖体大亚基蛋白RPL22高度同源。对其如何通过调控根瘤菌侵染而在共生结瘤过程中发挥重要作用进行了较为深入的探索。方法: 利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)分析RpRPL22在接菌后不同时间及不同植物组织的表达变化。利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得目的基因cDNA全长。通过GFP报告基因进行RpRPL22亚细胞定位分析。通过Gateway BP重组技术构建RNA干扰(RNAi)重组载体,借助电转化法将重组载体转至农杆菌K599,利用农杆菌介导植物根部,接菌后观察和测量植株表型。首先从宏观水平统计观察目的基因是否对结瘤过程有影响,其次从分子水平揭示目的基因在共生结瘤过程的重要功能。结果: 不同接菌时期、不同植物组织目的基因qRT-PCR相对表达量结果显示,几乎在所有取样的接菌时间,目的基因RpRPL22在接菌根中的相对表达量都低于未接菌对照根,只有接菌后第25天除外。在成熟的根瘤中,接菌后第25天该基因的表达量也最高。洋葱表皮和毛状根亚细胞定位结果均显示在椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子控制下,RpRPL22融合绿色荧光蛋白GFP的荧光信号在细胞核和细胞质有明显的表达。RNAi转化植株的表型统计观察结果,比如植株鲜重、植株的有效结瘤数目较对照组均有明显的降低;同时RNAi转化植株在根瘤菌侵染过程形成的侵染线数目和根瘤原基数目较对照均显著降低。根瘤切片实验用于观察根瘤显微超微结构,结果显示RNAi植株根瘤中固氮区的受菌侵染细胞数目与对照相比明显减少。电镜观察根瘤单个受菌侵染细胞中类菌体形态显示,RNAi根瘤中类菌体侵染细胞胞体多呈不规则形状,皱缩变形严重,环类菌体周间隙空间增大,多共生体融合,表现出细胞凋亡的迹象。对照根瘤中的受菌侵染细胞胞体多呈圆形椭圆形,胞质饱满丰富且分布均匀,细胞发育正常,表明RNAi植株根瘤发育过程明显受阻。结论: 核糖体蛋白(RP)能够参与调控豆科植物共生结瘤过程,相关同源基因RpRPL22可能在起始根瘤菌侵染植物和阻止类菌体降解过程中起重要作用。 相似文献
922.
短杆菌素是一种广谱抗菌肽,对细菌和真菌均有较好的抑制作用,具有潜在的抗生素替代价值。通过对侧孢短芽孢杆菌fmb70进行紫外诱变、亚硝基胍诱变、常压室温等离子体诱变,获得3株短杆菌素产量提高的诱变菌株。随后以诱变菌株为亲本进行两轮基因组改组,获得融合子F2-24,其短杆菌素产量为(340.5±16.35) μg/mL,是野生菌株fmb70短杆菌素产量的1.92倍。融合子传代5代后,该菌株短杆菌素产量无明显差异,说明菌株稳定性良好。最后对该菌株产短杆菌素的培养基和发酵条件进行优化,优化后的培养基为:4%蔗糖、2%牛肉膏、0.5%氯化镁,发酵温度30℃、培养24 h、培养基初始pH6.0。优化后的短杆菌素产量可达(442.45±9.58)μg/mL,是初始培养条件的2.50倍。 相似文献
923.
目的: 弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)作为氨基糖苷类抗生素新霉素的主要生产菌株,其新霉素B具有抗菌活性强、抗癌、抗HIV等作用,提高新霉素B的效价具有重要意义。方法: 在满足微生物正常生长所需盐离子的条件下,通过盐增强培养的方式向培养基中添加不同种类、浓度无机盐来改变细胞壁附近的理化特性、渗透压以及培养基中的碳氮比。结果: 不同无机盐对新霉素B效价影响程度由高到低为(NH4)2SO4、NaCl、KCl、K2SO4;当添加60 mmol/L(NH4)2SO4时新霉素B的效价达到最高为15 864 U/mL,而NaCl在80 mmol/L浓度时产量最高为7 429.7 U/mL,相比未添加无机盐分别提高3.8倍和0.82倍。在含有80 mmol/L的NaCl的发酵培养基中添加不同浓度的(NH4)2SO4并定时取样检测其中氨基氮、还原糖、pH、TG、菌浓以及新霉素B效价的变化,发现60 mmol/L(NH4)2SO4浓度下氨基氮、还原糖、TG的消耗速率加快,菌体比生长速率μ最大为0.097/h,新霉素B的合成加快且产量提高为17 399 U/mL,同时菌丝呈现出聚集变短的形态且产孢提前。结论: 盐增强培养方式既可以作为一种形态学工程手段,通过改变弗氏链霉菌的微观形态来促进次级代谢产物新霉素B产量的提高,同时也可以作为培养基优化策略来提高新霉素B的产量,这为进一步提高弗氏链霉菌中次级代谢产物产量的研究奠定了基础。 相似文献
924.
目的:为了更好地评价基因编辑效率,满足高通量筛选应用中快速、高效的检测要求,在细胞上建立一个原位检测方法具有重要的意义。通过检测荧光蛋白信号强度的变化可以评价CRISPR系统在细胞中的基因编辑情况,然而这一方法的效率受限于荧光蛋白较长的半衰期。方法:将鸟氨酸脱羧酶降解结构域(含PEST序列)与EGFP融合,通过慢病毒系统感染HEK-293T细胞,获得了表达单拷贝、EGFP-PEST报告基因的稳转细胞系。结果:与EGFP相比,EGFP-PEST在细胞内的降解速度明显加快,荧光水平在4 h内显著降低。利用该模型比较了3种商品化脂质体介导的CRISPR/Cas9基因编辑效率,能够在2~4 d实现定性和定量评价。结论:这一模型能够快速、灵敏地指示基因编辑效果,可以用于不同CRISPR系统或新递送工具的高通量筛选和评价。 相似文献
925.
我国果胶酶制剂使用广泛但专一性不高,高效、专一的果胶酶制剂在市场上仍然匮乏。利用基因工程技术改造果胶酶生产菌株——黑曲霉来生产单一成分的果胶酶成为解决果胶酶应用需求的一种有效方案。构建一种高效的CRISPR-Cas9基因编辑技术,可为构建高产单一性果胶酶的黑曲霉底盘菌株提供有效的基因编辑工具。首先敲除产果胶酶黑曲霉基因组上的pyrG基因构建尿嘧啶营养缺陷型菌株AnΔpyrG,并在AnΔpyrG菌株的pyrG基因位点定点整合Cas9基因表达盒和pyrG基因表达盒,构建组成型表达Cas9基因的黑曲霉菌株AnCas9,再构建含有gpdA启动子、锤头结构核酶、HDV核酶的稳定性表达sgRNA的pLM2-sgRNA质粒,建立CRISPR-Cas9基因编辑体系。利用该技术失活AnCas9菌株中的2个聚半乳糖醛酸酶基因4978020和4983861来检测构建的CRISPR-Cas9基因编辑效率并检测4978020基因功能缺失菌株的表型变化和产酶变化,结果表明果胶酶基因编辑效率大于50%,AnΔ4978020的表型和果胶酶酶活性与出发菌株均无明显变化。在黑曲霉中成功构建了高效的Cas9基因编辑技术,4978020基因功能缺失也不影响菌株表型,为构建高产单一性果胶酶黑曲霉底盘菌株奠定基础。 相似文献
926.
玉米为雌雄同株异花植物,其雄穗着生于植株顶部,雌穗腋生。雄穗一方面需产生足量花粉以保证雌穗授粉结实,另一方面由于对下部叶片的遮蔽作用和自身营养需求,其生长发育会同时影响叶片光合作用效率和能量分配,因此优化雄穗结构是提高玉米产量的重要措施之一。玉米雄穗性状包括雄穗分枝数、雄穗分枝长度、雄穗主轴长度、雄穗分枝总长度、雄穗分枝角度等,均为多基因控制的数量性状。自20世纪90年代,研究者开始利用数量性状位点(quantitative trait locus,QTL)定位方法解析玉米雄穗性状遗传结构;随着玉米自交系B73等参考基因组释放,以及DNA微阵列、基因组重测序等高通量基因分型技术的日益成熟,全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)成为数量性状遗传研究的主流方法,目前已鉴定出大量玉米雄穗性状遗传位点。通过总结雄穗性状遗传定位研究结果,构建一致性图谱并挖掘定位热点区间,有助于进一步了解雄穗性状遗传结构特征及指导雄穗性状候选基因克隆。此外,通过对调控雄穗发育的已知基因进行功能分类,可为解析玉米雄穗发育的遗传网络和调控通路提供理论支撑。 相似文献
927.
目的:预防马立克氏病病毒(MDV)和新城疫病毒(NDV)混合感染鸡引起的疾病,构建表达NDV F蛋白的MDV疫苗株CVI988 BAC重组载体,并包装成重组病毒,为疫苗免疫提供更多的重组疫苗选择。方法:首先利用PCR扩增带有卡那霉素(Kanamycin,Kana)抗性基因片段的F基因,采用同源重组的方法将其整合到CVI988 BAC上,进一步诱导I-SceI表达敲除Kana基因而获得重组质粒CVI988 BAC-F。通过磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞获得重组病毒。结果:Western blot和间接免疫荧光实验证实重组病毒能够表达F蛋白。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果表明,F基因的插入不影响病毒的体外增殖。结论:利用BAC技术成功构建了整合F基因的重组MDV病毒CVI988 BAC-F,为MDV重组疫苗研发,防控NDV与MDV共感染奠定了基础。 相似文献
928.
黏菌是土壤原生生物的重要组成部分,但其群落组成与多样性格局信息目前还不全面。本研究采用18S rRNA基因高通量测序的方法,研究了宝天曼自然保护区内落叶阔叶林、针叶林和针阔混交林土壤中的亮孢黏菌多样性,并通过多元统计方法分析了其群落结构与土壤环境因子之间的关系。结果表明,30份土壤样品中共获得26个亮孢黏菌的可操作分类单元(OTUs),隶属团毛菌目Trichiales下的7个属。4个OTUs可注释到种,分别为球圆团网菌Arcyria globosa、蛇形半网菌Hemitrichia serpula、刺丝团毛菌Trichia scabra和高山团毛菌Trichia alpina。亮孢黏菌群落α多样性在不同林型间有显著差异,其中在针叶林最高,落叶阔叶林最低。不同林型土壤的亮孢黏菌群落结构也显著不同,冗余分析显示,不同林型间黏菌群落结构差异与土壤含水量、碳氮比、有效钾和有机碳显著相关,但总体土壤环境因子对群落结构差异的解释量有限,占比10.18%。本研究丰富了土壤黏菌多样性信息和生态分布理论。 相似文献
929.
以1、2、3年生的楸树实生苗和嫁接苗(梓树砧木)根系为研究对象,通过对ITS rDNA区域标记扩增子的Illumina MiSeq测序,分析不同苗龄楸树实生苗和嫁接苗根相关真菌的结构组成和多样性。获得根相关真菌OTU共842个,分属4门、24纲、70目、134科、233属、347种;丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi)AMF-OTU共42个,分属1门、1纲、3目、3科、3属、13种。根相关真菌和AMF的OTU数量、丰度和多样性在实生苗中均随苗龄的增加而降低,而在嫁接苗中则随着苗龄的增加而增加。门水平上,实生苗与嫁接苗根相关真菌的优势菌都是子囊菌门Ascomycota、担子菌门Basidiomycota和接合菌门Zygomycota,但它们的相对丰度有所差异;属水平上,实生苗和嫁接苗根相关真菌的优势菌种在组成和数量上都具有一定的差异性。楸树根相关真菌拥有3种营养模式和12个生态功能群,其中实生苗根系中病理营养型真菌的比例大于嫁接苗,腐生营养型则差异不大,而共生营养型则小于嫁接苗。生态功能群分析显示大多数楸树根系真菌表现出多种生存策略,部分真菌可以在植物-真菌-动物中跨界侵染。该研究可为楸树根相关真菌的利用提供一定的理论依据和基础。 相似文献
930.
菌核是核盘菌Sclerotinia spp.在土壤中的主要存活形式和菌核病的主要初侵染源,在土壤中可存活8年以上,其数量和存活状况直接影响着菌核病的发生和危害程度。本研究以雪腐核盘菌Sclerotinia nivalis菌株SS-TB为材料,分析了菌核萌发的影响因素、致死温度以及土壤温度对菌核存活的影响。结果表明,未成熟菌核较成熟菌核更容易萌发;菌核萌发的最佳温度为20-25℃、pH为3.0-4.0、土壤含水量为20%-45%。菌核长时间浸泡水中对其存活不利,浸泡30d以后,存活率开始急剧下降,至47d时存活率为0。雪腐核盘菌菌核具有较强的耐高温特性,随着温度和处理时间的增加,菌核萌发率呈下降趋势。菌核在水浴中85℃ 5min、80℃ 10min、75℃ 10min、70℃ 30min、65℃ 120min、60℃ 180min时全部丧失活力。在土壤温度30℃和35℃处理5周、40℃和45℃处理4周时菌核全部失去活力。该研究结果为通过水旱轮作和土壤高温处理来防治西洋参菌核病提供了理论基础。 相似文献