利用响应面法优化红谷霉素发酵培养基*

在摇瓶条件下,对链霉菌702发酵生产过程中的主要培养基组成对产红谷霉素影响进行的研究。试验采用响应面法优化摇瓶发酵培养基,利用全因子实验设计筛选出对链霉菌702产红谷霉素重要影响因子黄豆饼粉和工业蛋白胨,应用最陡爬坡实验法接近重要因子的最优水平,然后应用中心复合设计确定重要因子的最优水平。优化后的培养基组成为：玉米淀粉20g,玉米粉20g,葡萄糖20g,磷酸二氢钾0．3g,蛋白胨9g,黄豆饼粉23g,硝酸钾2．5g,硫酸铵2．5g,豆油5mL,氯化钠3g,碳酸钙6g,定容至1L。实验结果表明,采用优化后的培养基,其发酵液红谷霉素效价达到1,500μg／mL,比优化前提高了3.08倍。     

莱氏野村菌产几丁质酶条件及酶学性质研究

对莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)菌株CQ031021产几丁质酶条件及酶学性质进行了研究。结果表明:该菌株最适产酶碳源为2.0%(W/V)葡萄糖,氮源为1.2%(W/V)复合氮源(蛋白胨、牛肉膏按1∶1的比例),接种量为孢悬液2mL(1×107个/mL),培养温度28℃,培养液初始pH6.0,培养时间6d;一定浓度的吐温-80对几丁质酶活性有促进作用,而SDS有抑制作用;粗酶液最适反应温度50℃,最适pH6.0,在40℃以下及pH5.5～6.5范围内酶活力较稳定。     

模拟氮沉降对华西雨屏区撑绿 杂交竹凋落物分解的影响

从2008年1月至2010年1月,对华西雨屏区撑绿杂交竹(Bambusa pervariabilis × Dendrocala mopsi)人工林进行了模拟氮沉降试验,氮沉降水平分别为对照(CK, 0 g · m^-2 · a^-1)、低氮(5 g · m^-2 · a^-1)、中氮(15 g · hm^-2 · a^-1)和高氮(30 g · m^-2 · a^-1)。利用凋落袋法对杂交竹凋落叶和凋落箨进行原位分解试验,并在每月下旬定量地对各处理施氮(NH₄NO₃)。结果表明,自然状态下杂交竹凋落叶和凋落箨分解95%所需时间分别为2.9,1.5 a;氮沉降显著抑制了凋落叶的分解,在分解后期3个氮沉降处理凋落叶无灰分质量残留率均显著大于对照,氮沉降对凋落箨分解无明显影响;氮沉降显著抑制了凋落叶中木质素和纤维素的分解。杂交竹凋落叶在分解后期质量损失缓慢,处于较稳定状态,氮沉降的增加使得凋落物的残留率稳定在一个更高的水平,表明氮沉降的增加可能会使更多的凋落物残体和稳定有机质留存于杂交竹林土壤中,从而增加杂交竹林土壤碳贮存。     

幽门螺杆菌尿素酶单克隆抗体的研制及鉴定

应用杂交瘤技术 ,建立稳定分泌抗幽门螺杆菌尿素酶单克隆抗体 (HPU McAb)的细胞系。用纯化幽门螺杆菌尿素酶 (HPU)抗原加福氏佐剂免疫BALB/c小鼠 ,按常规方法进行细胞融合 ,以纯化HPU抗原包被 ,间接ELISA方法筛选 ,并经多次有限稀释法克隆。获得 6株抗HPU的杂交瘤 ,腹水效价达 1∶6 .4× 10 4～ 1∶2 .5 6× 10 5,特异性专一 ,并对其进行体内外连续传代 3个月 ,分泌抗体能力稳定。IgG亚类分型主要为IgG1型。该细胞系能稳定分泌幽门螺杆菌尿素酶单抗。     

高密度发酵P.pastoris诱导表达葡聚糖外切酶

目的:应用P.pastoris的pAOX1表达系统表达CBH Ⅱ酶.方法:PCR法扩增木霉的cbh Ⅱ基因.将其克隆进P.pastoris表达载体pPIC9k,电转法将其cbhⅡ基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性的克隆为工程菌.重组CBH Ⅱ酶的生产是在50 L生物反应器中进行.连续24h补加甘油-PTM4增殖细胞,然后用甲醇诱导表达64h.结果:放罐时生物量为A600=180,重组CBHⅡ产量为80mg/L.表达产物具有酶解羧甲基纤维素的活性.结论:实现应用pAOX1表达系统在生物反应器中高密度发酵P.pastoris诱导表达CBH Ⅱ.该研究为重组CBH Ⅱ的规模化生产打下基础.     

模拟氮沉降对两种竹林不同凋落物组分分解过程养分释放的影响

利用原位分解袋法研究了华西雨屏区苦竹(Pleioblastus amarus)和撑绿杂交竹(Bambusa pervariabilis × Dendrocala mopsi)人工林几种凋落物组分在模拟氮沉降下分解过程中养分释放状态,试验周期为2 a。氮沉降水平分别为对照(CK, 0 g · m^-2 · a^-1)、低氮(5 g · m^-2 · a^-1)、中氮(15 g · m^-2 · a^-1)和高氮(30 g · m^-2 · a^-1),每月下旬定量地对各处理施氮(NH₄NO₃)。结果表明,苦竹林和杂交竹林凋落物主要由凋落叶、凋落箨和凋落枝组成,其中凋落叶约占80%;两个竹种凋落物在分解过程中养分元素释放的种间差异主要与初始养分元素含量有关;凋落物养分元素初始含量对元素释放模式和最终净释放率的大小具有重要的决定作用;目前,这两种竹林生态系统土壤氮输入主要以大气氮沉降(8.24 g · m^-2 · a^-1)为主,同时凋落物氮输入(苦竹和杂交竹林分别为1.93,5.07 g · m^-2 · a^-1)也是一个重要途径;模拟氮沉降对苦竹凋落物碳、磷、钾、钙元素和杂交竹凋落物碳、氮、磷、钾、钙、镁元素释放的抑制作用较弱,处理与对照之间元素总释放率差异一般小于10%;氮沉降显著抑制了苦竹林凋落物氮元素释放,减小幅度为19.0%-27.2%,但由于氮沉降增加对土壤肥力的直接改良作用,氮沉降的增加并不会因为凋落物分解速率的降低造成植物生长所需养分供应的减少;从短期来看,在氮沉降继续增加的情况下,该地区这类竹林生态系统的碳吸存能力仍可能会因为N沉降对植物生长的促进作用而增加。     

染色体整合系统在多价疫苗构建中的应用研究

通过同源重组将编码异源抗原的DNA整合到减毒的鼠伤寒沙门氏菌的染色体上,获得了表达霍乱毒素B亚单位（CTB）的双价活疫苗候选株。该系统包括两个步骤：首先将GisOG缺失突变的DNA片段整合进鼠伤寒沙门氏菌疫苗候选株SL3261的染色体上,得到His营养缺陷型。然后,用带有CTB抗原基因的完整HisOGDNA片段置换HisOG缺失的DNA片段,获得表达CTB的His回复的SL3261菌株（命名为TT201）。Southern杂交证明,TT201菌株的染色体带有CTB抗原基因。Westernblot分析表明,TT201菌株能表达CTB,且具有很好的稳定性。用重组菌株口服免疫接种小鼠,能够激发抗CTB抗体的产生。TT201菌株是一种潜在的双价疫苗候选株。     

MAL1基因启动子区的克隆及其在大肠杆菌中的启动功能分析

目的：MAL1基因启动子区在原核生物大肠杆菌中是否有双向启动外源基因的功能。方法：利用PCR扩增MAL1基因启动子区,将不同方向的MAL1基因启动子区后接上Zeocin基因,构建成重组报告质粒,转化大肠杆菌DH5α,验证该启动子区是否双向都具有启动外源基因的功能。结果：将含不同方向启动子区的重组质粒PUCMZ1和PUCMZ2,转化大肠杆菌,转化子均有Zeoein抗性。结论：证明了MAL1结构基因上游启动子区在原核生物大肠杆菌中具有双向启动的功能,且3′-5′方向的启动能力强于5′-3′方向。     

壳聚糖酶的分离纯化及性质研究

以实验室分离的产壳聚糖酶的LS菌株出发,制备壳聚糖酶粗酶液,经(NH_4)_2SO_4盐析、透析、DEAE-Sephadex A25阴离子交换、Sephadex G-100凝胶过滤分离纯化后,SDS-PAGE显示为一条带,壳聚糖酶被纯化了22.4倍,回收率为34.2%。同时对其酶学性质进行了初步研究,发现该酶在低于35℃和pH 6.O～7.5范围内较稳定,最适反应温度为55℃,反应pH 5.0～5.5;Zn~(2 )、Ag~ 、Ca~(2 )、Co~(2 )、Mn~(2 )对该酶有明显的促进作用,而Fe~(3 )、Hg~(2 )对该酶有强烈的抑制作用;该酶的米氏常数(K_m)为2.50 mg/mL,最大反应速度(V_(max))为4.19μmol/(mL·min);SDS-PAGE测定的相对分子质量为30.9×10~3。     

烟夜蛾几丁质酶基因的克隆与表达

运用RT-PCR技术扩增编码烟夜蛾Helicoverpaassulta(Guen啨e)幼虫几丁质酶基因的cDNA片段,将其克隆至pMD18-T载体,获得该基因的成熟蛋白阅读框序列。将该基因重组到表达型质粒pGEX-4T-2中,并转化入原核细胞中表达,序列测定结果表明,烟夜蛾幼虫几丁质酶基因的成熟蛋白阅读框全长1338bp,编码445个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为50.1kDa和9.26;推导的氨基酸序列与其近缘种棉铃虫几丁质酶氨基酸序列的一致性达99%,与其他6种昆虫几丁质酶的氨基酸序列也高度一致(65%~76%),并具有几丁质酶的典型特征。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上并转化BL21,SDS-PAGE和Western印迹分析表明,经IPTG诱导,76kDa附近没有特异蛋白条带出现,表明烟夜蛾几丁质酶基因不能在原核表达载体pGEX-4T-2中表达。