化感水稻种质资源鉴定及基因定位研究进展与展望

稻种资源化感作用的鉴定评价与深入研究是化感水稻品种选育的基础.本文概要介绍了化感水稻种质资源鉴定评价方法、化感作用生理生化机理以及化感特性遗传与基因定位方面的主要研究进展,并进一步讨论了水稻化感作用研究与利用的发展方向.     

大肠杆菌F18菌毛及其亚型的PCR鉴定

F18菌毛是产肠毒素大肠杆菌 (ETEC)与产vero细胞毒素大肠杆菌 (VTEC)的重要致病因子 ,可介导细菌对小肠细胞的黏附 ,并具有F18ab和F18ac 2个抗原亚型。根据已发表的F18ab菌毛A亚单位 (FedA ab)的基因 (fedA ab)设计 3条引物 ,建立了 2种聚合酶链式反应 (PCR)扩增方法。通过对F18ab 大肠杆菌、F18ac 大肠杆菌、K88 大肠杆菌、K99 大肠杆菌、987P 大肠杆菌、F4 1 大肠杆菌的试验 ,结果表明所建立的PCR方法可特异性鉴定F18 大肠杆菌并区别其亚型F18ab与F18ac     

共表达H5亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效地抵抗高致病性H5亚型禽流感病毒的基因工程疫苗,将H5亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因定向插入鸡痘病毒转移载体p11S中,H5A和NA基因的启动子分别为PS和PE/L,获得用不同的启动子启动不同的外源基因且两基因盒方向为背向串联的重组转移载体p11SH5ANA。将p11SH5ANA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5ANA与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-11SH5ANA。通过在含X-Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得纯化的重组病毒。经传代证实该重组病毒具有良好的遗传稳定性。用105PFU的rFPV-11SH5NA免疫无特定病原体(SPF)鸡,能激发机体产生有效的血凝抑制(HI)抗体。初步的动物试验表明,该重组病毒能使经肌肉注射攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为100%,显示出一定的应用前景。     

嵌合猪圆环病毒PCV1-2的构建及其感染性初步鉴定

猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)是当前严重危害养猪业的重要病原之一。目前,世界上还没有有效疫苗用于该病毒的免疫预防。该研究利用PCR方法,将PCV2的ORF2基因替换猪Ⅰ型圆环病毒(PCV1)的ORF2基因,构建了以PCV1基因组为骨架的嵌合病毒(PCV1-2)分子克隆(pSK2PCV1-2)。将该分子克隆转染PK-15细胞并连续盲传5代,用RT-PCR方法可以在转染后盲传的细胞中检测到PCV1的ORF1 mRNA和PCV2的ORF2 mRNA,但检测不到PCV1的ORF2 mRNA和PCV2的ORF1 mRNA。间接免疫荧光检测显示在盲传第5代的细胞中有PCV2 ORF2蛋白的表达,表达蛋白主要分布于细胞核。该研究初步证实构建的PCV1-2分子克隆转染细胞后可以形成具有感染性的嵌合病毒,从而为更深入研究嵌合病毒生物学特性奠定了基础。     

断奶仔猪源大肠杆菌LEE及HPI毒力岛的检测

应用Duplex_PCR方法,对240株断奶仔猪源大肠杆菌分离株的LEE毒力岛的eaeA基因和耶尔森菌强毒力岛核心区的irp2基因进行了检测,并对HPI毒力岛的fyuA基因及其在大肠杆菌染色体中的插入位置进行了分析,以及随机选取部分PCR产物进行了克隆和序列分析。结果表明:其中29株(12.08%)为LEE HPI ,39株(16.25%)为LEE ,11株(4.58%)为HPI ;另外还发现:不同病例来源的分离株之间,两种毒力岛的携带率不同;在断奶仔猪腹泻源分离株中,29株(20.71%)为LEE HPI ,22株(15.71%)为LEE ,9株(6.43%)为HPI ;断奶仔猪水肿病源分离株中,仅5株(6.58%)为LEE ,2株(2.63%)为HPI ,未发现LEE HPI 菌株;断奶仔猪水肿病并发腹泻源分离株中,仅12株(50%)为LEE ,未发现HPI 及LEE HPI 菌株。本实验克隆的eaeA(425bp)与已发表序列完全一致,irp2(280bp)f、yuA(948bp)、asn_tRNA_intB(1391bp)均与已发表的序列高度同源,同源性分别在98.2%、98.3%、95.8%以上;40株LEE HPI 或HPI 分离株中,29株(72.5%)为fyuA ,且其HPI毒力岛位于大肠杆菌染色体asn_tRNA位点。     

利用DGGE评价不同培养基回收番茄根际细菌类群的能力

用营养肉汤、YG、根系分泌物、土壤浸渍液4种培养基从番茄根际分离培养细菌,并结合变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术,对4种培养基回收番茄根际细菌种群的能力进行了比较研究。结果表明,不同培养基和培养温度,回收到的细菌种群有一定差异;低营养浓度的YG培养基在较低的培养温度20℃下进行较长时间的培养,比高营养浓度营养肉汤培养基产生更多、更具代表性的细菌;以根系分泌物为基础的培养基从番茄根际回收到的优势菌群最多。该研究初步建立了用DGGE技术对不同培养基回收分离细菌种群能力进行评价的方法。     

腾冲嗜热厌氧菌热休克蛋白60及其基因表达的热激动态变化分析

热休克蛋白60(HSP60)是细菌体内一种非常重要的分子伴侣,其可以协助蛋白质或肽链的正确折叠和构型,防止变性和降解。基于本实验室的早期观察,腾冲嗜热厌氧菌的HSP60是一个典型的温度相关蛋白质,在80℃的表达水平最高。为了进一步了解嗜热菌应急的分子机制,继续进行了在热激后HSP60基因表达的动态研究。将最适温度(75℃)下培养的腾冲嗜热厌氧菌迅速地转移至80℃继续培养,然后在不同的时间点上分别取样,并通过双向电泳、Western blot和Real_time PCR等方法,分析了HSP60在mRNA和蛋白质水平上的表达量的改变。试验结果表明,在80℃热处理4h内的短期应急过程中,HSP60蛋白水平一直呈上升趋势,而它的mRNA水平则表现为先升高后下降的一个非对称性的峰形变化。HSP60的mRNA和蛋白质的对温度的应答快慢程度是不同的。HSP60的mRNA水平的显著变化在1h内便可观察到,而蛋白质水平的显著改变要延迟3h左右。此外,HSP60的mRNA和蛋白质对温度的应答量变大小也是不同的。     

中国希瓦氏菌D14^T的厌氧腐殖质呼吸

实验证明,希瓦氏菌新种(ShewanellacinicaD14T)在厌氧条件下可以利用多种有机酸盐和甲苯等环境有毒污染物作为电子供体,以腐殖质作为唯一末端电子受体进行厌氧呼吸(即醌呼吸)。电子在细胞膜呼吸链的传递过程中,偶联能量的产生来支持菌体的生长,1mmol/LAQDS可支持细胞增殖约60倍。电子供体的氧化和唯一电子受体腐殖质还原之间存在着动态的偶联过程,随着电子供体量的增加腐殖质还原的量也随之增加。典型呼吸链抑制剂诸如:抑制Fe-S中心的Cu2 ,甲基萘醌类似物标桩菌素,抑制甲基萘醌氧化型向还原型转化的双香豆素和细胞色素P450的专一抑制物甲吡酮等对腐殖质的还原有着极为显著的抑制作用,为进一步证明希瓦氏菌(Shewanellacinica)D14T可利用腐殖质进行厌氧呼吸提供了有力的佐证。而D14T在进行腐殖质呼吸的同时,对于甲苯,苯胺等环境有毒物质的有效降解则具有着重要的环境学意义。     

Sinorhizobium morelens S-5中N-氨甲酰基水解酶基因的克隆、表达和纯化

N-氨甲酰基水解酶是一种非常具有工业应用价值的水解酶,可用于制备光学纯氨基酸。通过LA PCR从Sinorhizobium morelensS-5菌中克隆到1.3kb的DNA片段,测序表明该片段上含有一个完整的N-氨甲酰基水解酶的基因(hyuC)序列。将hyuC基因克隆到表达载体pET30a上,重组质粒pET30a-HyuC在大肠杆菌中获得了高水平表达。重组的N-氨甲酰基水解酶经过热处理和三步柱色谱分离而纯化。纯化倍数为16.1倍,收率21.2%。该酶为同源四聚体,亚基分子量是38kDa。最适温度是60℃,最适pH为7.0。该酶有较高的热稳定性和氧化稳定性。Fe2 和Ca2 对酶的活性有一定的促进作用,而金属螯合剂和巯基试剂对酶活无明显影响。     

黄、东海生态系统中鱼卵、仔稚幼鱼种类组成与数量分布

2000年秋季和2001年春季“北斗号”生物资源调查船利用大型浮游生物网采用表层水平拖网的调查方式对黄、东海鱼卵、仔稚幼鱼种类组成与数量分布进行了调查。秋季和春季分别设置66个(黄海26个,东海40个)和98个(黄海46个,东海52个)调查站。每站拖网10min,拖网速度为3.0nmile/h。调查结果表明:秋季和春季所采集到的鱼卵和仔稚幼鱼样品共62种以及鳗鲡目和飞鱼类两大类,鉴定到种的44种,隶属于9目33科40属;还有10种仅能鉴定到属,6种和飞鱼类仅能鉴定到科,1种和鳗鲡目一大类仅能鉴定到目以及1种不能识别。优势种为、鲐、带鱼、棱、黑鳃梅童鱼、绿鳍鱼以及多鳞、鼠、大泷六线鱼、细纹狮子鱼等。2000年秋季,从黄海和东海分别采集到16粒鱼卵、107尾仔稚幼鱼和495粒鱼卵、116尾仔稚幼鱼。鱼卵、仔稚幼鱼的出现频率分别为26.92%、38.46%和65.00%、40.46%,平均密度分别为0.6粒/站、3.6尾/站和12.4粒/站、2.8尾/站。2001年春季,从黄海和东海分别采集到3粒鱼卵、61尾稚幼鱼和17587粒鱼卵和1560尾仔稚幼鱼,鱼卵、仔稚幼鱼的出现频率分别为2.17%、39.13%和57.69%、48.08%,平均密度仅分别为0.07粒/站、1.3尾/站和338.2粒/站、30.0尾/站。秋季,黄海区的硬骨鱼类进入产卵末期,而东海区才刚刚进入产卵末期。春季,黄海区的硬骨鱼类刚刚进入产卵初期,而东海区已进入产卵盛期。此外,对秋季和春季鱼卵和仔稚幼鱼的数量分布以及鼠、、棱、多鳞、少鳞、黑鳃梅童鱼、小黄鱼、鲐、带鱼、绿鳍鱼、大泷六线鱼和细纹狮子鱼等优势种类的鱼卵和仔稚幼鱼数量分布进行了详尽的描述。2000年和2001年黄海区鱼卵、仔稚幼鱼的种类组成与1985年和1986年发生了明显的变化,这与黄海区渔业资源和鱼类群落结构的变化是相符合的。从而说明人类的长期捕捞活动对海洋生态系统中鱼类资源的种群交替和鱼类群落结构的变化产生了较大的影响