黑腹果蝇GABA受体GRD亚基和LCCH3 亚基的克隆、表达与鉴定

昆虫GABA受体（γ-aminobutyric acid receptor, GABAR）是杀虫剂的重要靶标之一。本研究以黑腹果蝇Drosophila melanogaster整体组织的cDNA作为模板, 采用RT-PCR技术扩增了黑腹果蝇GABA受体LCCH3亚基和GRD亚基的cDNA序列, 并克隆至pET-32a表达载体上, 测序结果表明获得的序列与基因库中已发表的序列一致性在99%以上, 无移码突变。在IPTG的诱导下, LCCH3基因成功在大肠杆菌Escherichia coli中表达, 而GRD基因未表达。通过包涵体洗涤、变性、Ni²⁺亲合层析纯化、稀释复性获得纯化的重组表达的LCCH3蛋白, 并用圆二色谱测定了目标蛋白的二级结构, 主要富含β结构。该研究结果为研究昆虫GABAR的结构和功能关系提供了重要的参考数据。     

真核细胞顺乌头酸酶活性检测新技术——胶内酶活性分析法

顺乌头酸酶（aconitase,Aco）是细胞内重要的铁硫蛋白酶,它催化细胞内柠檬酸经中间产物顺乌头酸生成异柠檬酸. 真核细胞中顺乌头酸酶有两种,分别定位在细胞质的顺乌头酸酶1（c-Aco）和定位在线粒体的顺乌头酸酶2（m-Aco）.检测它们活性的变化能敏感地反映出细胞中能量代谢、自由基产生、铁硫簇组装及铁代谢水平的改变. 顺乌头酸酶活性的传统检测方法通常是测定细胞中总的顺乌头酸酶活性,该方法难以准确区分出c-Aco和m-Aco各自的活性变化.因此我们建立一种胶内酶活性分析法检测顺乌头酸酶活性. 该方法利用非变性电泳技术将c-Aco和m-Aco浓缩分离,通过泡染底物显色,条带颜色深浅反映了酶活性的强弱. 同时,比较了胶内酶活性分析法和分光光度法检测细胞内c-Aco和m-Aco的活性,并对比检测了过氧化氢处理细胞前后Aco活性的变化.结果显示,这两种方法均可敏感地检测出Aco的活性改变,并有广泛的细胞系实用性,但胶内酶活性分析法可区别测定c-Aco和m-Aco活性,不需繁琐的细胞质和线粒体分离,简便易行.文中介绍的线粒体分离纯化技术也为线粒体功能深入研究提供了一个快速、高效的分离纯化方法.     

光照下菜豆叶片抗氰呼吸与光合作用关系的分析

为了进一步了解光照下植物呼吸作用的内在机理以及呼吸作用和光合作用的关系, 该文研究了在光照下菜豆(Phaseolus vulgaris)叶片抗氰呼吸与光合作用的关系。研究发现, 将黑暗下生长的菜豆幼苗叶片转到光照下10 h, 总呼吸、抗氰呼吸以及抗氰呼吸在总呼吸中的比例均逐步上升; 光照也导致了叶片叶绿体光合放氧和CO₂固定的出现及其速率的增加, 但光合放氧和CO₂固定速率的增加均滞后于抗氰呼吸的增加。将黑暗下生长的叶片转到光照下之前用抗氰呼吸的抑制剂水杨基氧肟酸(SHAM)处理叶片, 发现用SHAM处理并没有导致叶片在光照下光合放氧和CO₂固定速率的明显变化, 这也提示了黑暗下生长的叶片转至光照的过程中, 抗氰呼吸和光合作用没有产生偶联。进一步研究发现, 在黑暗中对叶片施加短时间的光照能够增加抗氰呼吸在总呼吸中的比例, 但短时间的光照对叶片光合CO₂固定速率没有影响。这些结果表明了光照对抗氰呼吸的诱导可以不依赖于光合作用, 光照可能是作为一种直接的信号去诱导抗氰呼吸。     

不同来源可溶性有机物对亚热带森林土壤CO2排放的影响

采用室内培养法, 比较分析了亚热带地区杉木(Cunninghamia lanceolata)和米槠(Castanopsis carlesii)鲜叶及凋落叶浸提得到的可溶性有机物(dissolved organic matter, DOM)组成和化学性质差异对土壤CO₂排放的影响。结果表明: 添加不同来源的DOM后, 土壤CO₂瞬时排放速率在培养第1天内均显著高于对照(添加去离子水) (p < 0.05), 分别比对照增加了91.5% (添加杉木鲜叶DOM)、12.8% (添加米槠鲜叶DOM)、61.0% (添加杉木凋落叶DOM)和113.3% (添加米槠凋落叶DOM), 但培养5天后, 分别下降到对照的24.1%、8.3%、14.6%和13.2%, 随后逐渐趋于平稳。单次添加外源DOM到土壤中, 引起土壤CO₂排放速率增加的强度较大, 但持续时间短暂。培养31天时, 添加不同来源的DOM均对土壤CO₂累积排放量具有显著影响(p < 0.05), 而在培养59天时, 添加杉木鲜叶和凋落叶DOM的土壤CO₂累积排放量均显著高于添加米槠鲜叶和凋落叶DOM的土壤CO₂累积排放量, 但添加相同树种鲜叶与凋落叶DOM的土壤CO₂累积排放量之间差异不显著。培养结束后, 添加杉木鲜叶DOM和杉木凋落叶DOM后增加的土壤碳排放量, 分别是外源添加可溶性有机碳量的1.76倍和2.56倍, 而添加米槠鲜叶DOM和米槠凋落叶DOM后增加的土壤碳排放量只占外源添加可溶性有机碳量的22.5%和50.0%, 表明单次添加不同来源的DOM对土壤总有机碳库的影响是不一致的。     

RanGTPase激活蛋白RanGAP在嗜热四膜虫细胞中的定位及功能

RanGTPase激活蛋白（RanGTPase activating protein,RanGAP）和Ran相互作用,提高了Ran GTPase水解GTP的效率. RanGAP参与细胞内核质运输、纺锤体组装、核膜重建和异染色质的组装．生物进化过程中,不同生物的RanGAP表现出结构和功能的多样性．本研究从嗜热四膜虫大核基因组中鉴定出1个保守的RanGTPase激活蛋白基因RanGAP（TTHERM_00766430）．实时荧光定量PCR表明,RanGAP在四膜虫营养生长、饥饿和有性生殖过程中均有表达,且在有性生殖4～6 h表达水平最高．免疫荧光定位表明,在营养生长期、饥饿期及有性生殖的早期,RanGAP定位于细胞质中| 在有性生殖后期, RanGAP定位于凋亡的大核中．过表达RanGAP的细胞增殖速率下降,大核分裂和胞质缢缩异常, 产生无大核细胞．敲减RanGAP的细胞大核形态异常,细胞增殖速率下降,无丝分裂受到抑制,进而产生无大核细胞．RanGAP的过表达或敲除分别引起四膜虫RAN1,RanBP1和RCC1基因的表达下调或上调．结果表明,RanGAP通过Ran信号通路调控了嗜热四膜虫无性生殖过程中大核的无丝分裂,并可能参与了有性生殖过程中亲本大核的凋亡．     

零模波导原理、制备及其在单分子荧光检测中的应用

单分子荧光检测作为一种能够表征分子个体性质及行为的分析方法,有助于揭示利用传统荧光检测方法无法得到的信息,在近年来受到人们的广泛关注。利用传统光学检测设备进行单分子荧光检测时,由于受到衍射极限的限制,同时为了保证在观测体积内只有单个荧光分子,仅能采用无限稀释溶液的方法实现单分子荧光检测。虽然这种方法可以满足单分子检测的要求,但是由于大部分酶分子正常工作时底物的生理浓度都非常高,底物浓度的大幅度降低会对酶分子的反应机制等方面造成影响。零模波导作为一种新型的单分子检测器件,通过纳米微孔结构突破了光学衍射极限的限制将观测体积降至仄升量级（10-21L）,使得在生理浓度范围内检测单分子荧光成为可能,在单分子荧光检测领域得到了广泛应用。因此,就零模波导的原理、制备工艺及其在单分子DNA测序、生物膜、生物大分子之间的相互作用及单分子反应动力学方面的具体应用进行综述。     

木瓜三萜对吲哚美辛致胃黏膜损伤小鼠胃酸分泌及胃黏膜屏障的影响

观察木瓜三萜对吲哚美辛致胃黏膜损伤小鼠胃酸分泌及胃黏膜屏障的影响,在此基础上探讨其可能的机制。实验时,将小鼠随机分为正常组、模型组、木瓜三萜(50、100mg/kg)和奥美拉唑(20mg/kg)组。将给药组灌胃给予相应的药物,正常组和模型组灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液,给药6小时后,除正常组外,灌胃给予20mg/kg的吲哚美辛,每天一次,连续7天。末次给药次日,小鼠用水合氯醛麻醉后,固定,剪开腹腔,进行胃黏膜血流量的测定,然后取胃检测胃液量、胃液酸度和胃结合黏液量;检测胃黏膜中表皮生长因子基因(EGF)和三叶因子1基因(TFF1)的mRNA和蛋白表达。研究发现:吲哚美辛致胃黏膜损伤模型组小鼠胃液分泌量,胃液酸度、胃黏膜血流量、胃结合黏液量及胃黏膜组织中EGF和TFF1的mRNA和蛋白表达明显降低,与正常组比较均具有统计学差异(P<0.01);用木瓜三萜预处理后,上述异常的变化均得到了有效逆转,与模型组比较具有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。实验结果表明木瓜三萜(50、100mg/kg)对吲哚美辛致小鼠胃黏膜损伤具有较好的保护作用,通过上调EGF和TFF1的表达水平,增加胃液分泌量、胃液酸度、胃黏膜血流量、胃结合黏液量,恢复胃黏膜防御屏障的功能可能是其治疗吲哚美辛致胃黏膜损伤的机制之一。     

810nm弱激光照射对大鼠急性脊髓损伤后巨噬细胞极化的作用研究

本研究构建急性大鼠脊髓夹伤模型,并将大鼠随机分为单纯脊髓损伤对照组及脊髓损伤联合弱激光照射组。照射组应用810 nm波长,150 m W照射功率,照射光斑0.3 cm^2的弱激光对脊髓损伤区进行经皮照射,连续照射3天,7天或14天。应用免疫荧光、免疫印迹实验方法,测定脊髓损伤区巨噬细胞及小胶质细胞的极化表达。应用酶联免疫吸附法测定脊髓损伤区白细胞介素4的表达情况。应用坚牢蓝髓鞘染色测定两组损伤脊髓中髓鞘保留的差异。采用BBB评分对两组大鼠后肢运动功能的恢复进行评估。结果表明,810 nm弱激光对脊髓损伤区连续照射3天,7天后,可显著减少M1型巨噬细胞及其标志物诱导型一氧化氮合酶的表达,在7天时间增加M2型巨噬细胞及其标志物精氨酸酶1的表达。弱激光照射组白细胞介素4的表达明显增加。损伤后14天,弱激光照射组脊髓损伤区髓鞘保留面积比值明显提高。损伤后7天及14天时,弱激光照射组大鼠的BBB评分明显升高。该实验结果表明,810 nm弱激光经皮照射,可增加大鼠急性脊髓损伤区M2型巨噬细胞及小胶质细胞的表达,并减少脊髓损伤后的髓鞘脱失,促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复。     

Elevated acetyl‐CoA by amino acid recycling fuels microalgal neutral lipid accumulation in exponential growth phase for biofuel production

Microalgal neutral lipids [mainly in the form of triacylglycerols (TAGs)], feasible substrates for biofuel, are typically accumulated during the stationary growth phase. To make microalgal biofuels economically competitive with fossil fuels, generating strains that trigger TAG accumulation from the exponential growth phase is a promising biological approach. The regulatory mechanisms to trigger TAG accumulation from the exponential growth phase (TAEP) are important to be uncovered for advancing economic feasibility. Through the inhibition of pyruvate dehydrogenase kinase by sodium dichloroacetate, acetyl‐CoA level increased, resulting in TAEP in microalga Dunaliella tertiolecta. We further reported refilling of acetyl‐CoA pool through branched‐chain amino acid catabolism contributed to an overall sixfold TAEP with marginal compromise (4%) on growth in a TAG‐rich D. tertiolecta mutant from targeted screening. Herein, a three‐step α loop‐integrated metabolic model is introduced to shed lights on the neutral lipid regulatory mechanism. This article provides novel approaches to compress lipid production phase and heightens lipid productivity and photosynthetic carbon capture via enhancing acetyl‐CoA level, which would optimize renewable microalgal biofuel to fulfil the demanding fuel market.