毕赤酵母高效分泌长效人生长激素的研究

目的:为了延长人生长激素(HGH)在血浆中的半衰期,构建了高效分泌表达人血清白蛋白(HSA)与HGH融合蛋白(HSA-HGH)的工程毕赤酵母菌株。方法:从人胎肝cDNA文库中扩增HSA基因,从HGH工程菌载体中扩增HGH基因,将其克隆至真核表达载体pHIL-D2,载体线性化后采用电击法转化毕赤酵母GS115。通过原位双层膜法筛选高效分泌表达菌株。分别采用SDS-PAGE和Western印迹鉴定融合蛋白。对工程酵母培养条件进行研究,发酵液经离子交换层析、亲和层析和分子筛层析纯化。纯化的蛋白经N端序列测定,分子量测定和等电聚焦电泳进行鉴定。冻干的蛋白制剂经食蟹猴试验进行药代动力学和药效动力学测试。结果:确立了工程酵母的最佳培养工艺,融合蛋白表达量达100mg/L。纯化后蛋白纯度达95%以上,得率达42%。融合蛋白与预期结果一致,经食蟹猴试验,显示有良好的生物活性,与等摩尔剂量的重组人生长激素相比,半衰期延长6.8倍,清除率慢44倍。结论:融合蛋白呈现明显的长效动力学特征,为开发重组长效人生长激素HSA-HGH融合蛋白药物(rHSA-HGH)奠定了基础。     

利用重组HPV16L1抗原检测宫颈癌抗L1或VLP抗体的对比

为了评价重组大肠杆菌表达的HPV16L1蛋白和重组腺病毒表达的HPV16L1-VLP两种抗原在检测宫颈癌抗16 L1或VLP抗体及在宫颈癌血清学诊断意义上的差别,应用PCR技术从宫颈癌组织的DNA中扩增出全长1535bp的HPV16L1基因片段,克隆至pUC18-T载体中,进行DNA测序鉴定.然后,将HPV16L1基因克隆至pGEX-2T表达载体中,并诱导表达HPV16L1融合蛋白,分子量为83kD,能被HPV16L1单克隆抗体所识别.经GST柱层析法纯化后,与重组腺病毒表达的HPV16L1-VLP分别经酶联免疫吸附(ELISA)法检测12份宫颈癌患者和35份献血员血清.12例宫颈癌血清标本中,抗HPV16L1蛋白的抗体阳性率为7例(占 58.3%);抗HPV16L1-VLP的抗体阳性率为8例(占 66.7%).经大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1检测为HPV16抗体 IgG(+)的 7份患者血清,利用HPV16L1-VLP试剂盒检测均阳性;经大肠杆菌表达的重组抗原检测为HPV16抗体 IgG(-)的5 份患者血清,利用HPV16L1-VLP试剂盒检测有1份阳性.两者对HPV16抗体的阳性检出率并无显著差异(P>0.05).本实验结果说明HPV16与宫颈癌高度相关,利用大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1和HPV16L1-VLP重组抗原检测抗体的敏感性并不受影响.利用重组抗原HPV16 L1对宫颈癌的抗体进行定性、定量分析有助于该疾病的诊断.     

固定化硝化菌群联合芽孢杆菌处理对虾养殖废水

【背景】高度集约化的对虾养殖业面临着日益严重的水污染问题,同步高效降解养殖废水中的有机物、氨氮和亚硝酸盐是对虾养殖业健康可持续发展的重要保障之一。【目的】通过分别固定化硝化菌群(Nitrifyingbacterialconsortia,NBC)和芽孢杆菌,优化菌群空间结构,提高菌群功能,实现同步高效降解对虾养殖废水中的有机物、亚硝酸盐和氨氮,保障南美白对虾养殖的可持续发展。【方法】采集养殖虾塘底泥进行硝化细菌自养富集和连续培养,利用16S rRNA基因高通量测序技术分析硝化菌群组成。从5株芽孢杆菌中筛选化学需氧量(Chemical oxygen demand,COD)降解能力最强的菌株。选用吸附和成球效果好的无毒包埋材料,通过正交实验优化固定化配方提高机械强度。选择硝化菌群和芽孢杆菌最适使用浓度进行分别固定化并联合应用于对虾养殖废水的处理。【结果】高通量分析结果显示硝化菌群中变形菌门(Proteobacteria,61.10%)占绝对优势,具有自养硝化功能的类群丰度达12.69%并呈高多样性。还包含丰度达47.44%的具有反硝化功能或者潜在反硝化功能的优势菌群和丰度达12.85%的光合细菌,是高有机负荷下硝化作用的重要补充,并可通过反硝化作用实现真正脱氮。COD降解能力最强的是解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefacien)YL-10,48h内COD降解率达100%。固定化最佳配方为贝壳粉5%、海藻酸钠3%、交联剂氯化钙为4%、优化后的固定化小球其机械强度可达129.68m N。固定化使硝化菌群的氨氮和亚硝酸盐降解率分别提高了128.13%和130.11%(P0.05),但对芽孢杆菌YL-10的COD降解率无明显提高。1×10~8 CFU/mL为硝化菌群和芽孢杆菌YL-10在养殖废水中最适使用浓度。在固定化硝化菌群和芽孢杆菌YL-10联合作用下,对虾养殖废水的氨氮、亚硝酸盐和COD浓度在48h内分别由初始的6.32±0.12、5.69±0.11和65.29±1.14 mg/L降至0.03±0.03、0.06±0.01和0 mg/L (P0.05),降解率分别为99.57%、99.03%和100%。【结论】通过优化固定化有效提高硝化菌群的硝化作用,联合COD降解能力强的芽孢杆菌,同步高效降解对虾养殖废水中的有机物、氨氮和亚硝酸盐,为规模化应用于南美白对虾高密度养殖提供科学依据。     

PTK2B与Aβ、Tau和LRP-1在APP/PS1小鼠海马组织和血液中的表达随月龄变化的分析*

目的: 探讨阿尔茨海默病(AD)转基因动物模型脑组织中ptk2b基因及其表达产物PTK2B蛋白随着月龄的变化规律,及其与血液和脑组织中Aβ_1-42、Tau蛋白磷酸化和LRP-1含量的关系。方法: 设5月龄、10月龄、15月龄的APP/PS1转基因小鼠3个实验组,和同月龄的C57BL/6J小鼠3个对照组,共计6组,每组各8只。用Morris水迷宫检测各组小鼠的认知行为学能力,免疫组织化学、Western blot或ELISA检测小鼠海马组织或血液中PTK2B、Aβ_1-42、p-Tau /Tau和LRP-1的表达,qRT-PCR检测海马ptk2b mRNA的表达。结果: 各实验组结果显示,APP/PS1转基因小鼠随着月龄的增长海马组织中PTK2B、ptk2b mRNA和Aβ_1-42、p-Tau/Tau的表达均呈现逐渐增加,而血液中的Aβ_1-42则逐渐降低;海马组织中LRP-1表达也逐渐下调,同时,小鼠的认知行为学功能则表现为时间依赖性降低(P均＜0.05)。各对照组之间比较,除海马组织中LRP-1随着年龄增加而降低(P＜0.05)以外其余指标均没有明显差异(P＞0.05)。结论: APP/PS1转基因小鼠海马组织中PTK2B、Aβ_1-42、p-Tau/Tau的表达上调和LRP-1下调,与其认知功能降低均呈现时间依赖性变化。     

青海湖裸鲤性腺发育的组织学研究

采用石蜡组织切片法,对青海湖裸鲤的性腺发育进行组织学研究,系统地描述了各期卵巢和精巢的形态结构、特征及变化。结果表明:(1)青海湖裸鲤性腺的发育可分为六个时期,卵母细胞从第3时相发育到第4时相基本同步。第Ⅳ期末卵巢,第4时相卵母细胞的卵径大小比较整齐,卵径平均值为2.3mm,第4时相卵母细胞占切面上卵数的85%以上,占切片面积的96%以上,第2、3时相卵母细胞已很少;(2)产后卵巢的组织结构逐步由第Ⅵ期回复到第Ⅱ期,再由第Ⅱ期到第Ⅲ期向第Ⅳ期过渡;(3)性成熟个体有68.12%的雌鱼和83.9%的雄鱼以第Ⅳ期性腺越冬,另有21.01%的雌鱼和10.7%的雄鱼以第Ⅲ期性腺越冬,还有10.87%的雌鱼和5.4%的雄鱼以第Ⅱ期性腺越冬。根据青海湖裸鲤各季节性腺发育情况,作者认为青海湖裸鲤已达到性成熟的个体并不是每年都参与繁殖活动,存在生殖间断性。这反映了青海湖裸鲤的繁殖习性对高原寒冷多变气候的适应性。还对卵黄核和核仁在卵黄形成中的作用以及青海湖裸鲤的产卵类型和生殖间断性进行了讨论。     

利用随机效应模型模拟东北三省胡桃楸地位指数

通过精确模拟东北三省胡桃楸多形地位指数混合效应模型,为胡桃楸立地质量评价提供科学依据,本研究在辽宁、吉林和黑龙江三省23个典型区域内,采用样圆法布设样地197块,测定样地内胡桃楸树高-年龄数据,共得到数据1537组,同时将立地因子进行划分和赋值,应用方差分析和模型拟合进行计算。结果表明: 坡位是影响胡桃楸优势木生长最显著的因素,其次为土壤深度、坡度和坡向等;对8种常见基础模型进行拟合与分析,发现逻辑斯蒂模型H=a/[1+exp(b+cA)]为最优基础模型(R²=0.70),平均绝对误差(MAE)为2.52;对4种主要影响因素进行随机组合,得到随机组合因素最优地位指数模型M_8.15,其R²=0.90,提高了基础模型的拟合精度;采用K均值聚类分组法进一步将初始的立地类型划分为6个立地类型组,按6个立地类型组建立的非线性混合效应模型M_final,即H=(20.1837+u_i)/[1+exp (1.7352-0.0961A)]+ε_ij,其R²=0.92,AIC=912.65,模型的拟合度和精确度显著提高,可以用于东北三省复杂立地类型下胡桃楸立地质量的准确评价。     

PCR扩增试验的动力学数学模型

PCR技术已日趋成熟,但因为影响因素较多、反应过程比较复杂,直到目前PCR技术已创立近二十年,尚未能给出较好的描述PCR 反应的数学方法。我们根据它的基本原理提出了能够描述其反应过程的动力学方程：Wamp=［Ntarg×(1+P)n1+0.5×Cenz×U×P×Ceactiv×(n-n1)-Ntarg× (1+n×P)］×Cu×M,准确地描述了PCR反应的产物积累规律,建立了PCR反应的动力学数学模型。用动力学数学模型预测的PE 7700仪器的CT值与仪器的实际数值一致。动力学数学模型配合适当的监测设备可以构成自动化的PCR 定量仪器。PE 7700 仪器使用本动力学模型处理、分析数据,定量结果的准确性会更好。各实验室可根据各自的实验条件,由模型估算PCR产物数量,为PCR后产物继续处理提供较准确的数量信息。本模型阐明了PCR反应在多次循环后必然由指数扩增转变为线性扩增的分子基础,为定量PCR 提供了准确的计算方法。 Abstract:The PCR technique has been set up for nearly twenty years and is becoming more and more ripe.But because of the multiple influencing factors and complicated reaction procedures,no mathematical method that can describe the PCR reaction has been given.On the basis of its elementary principle,we suggested a kinetic equation to describe the reaction procedure,Wamp=［Ntarg×(1+P)n1+0.5×Cenz×U×P×Ceactive×(n-nl)-Ntarg×(1+n×P)］×Cu×M.This equation can describe correctly the accumulation rule of PCR product and thus build up the kinetic-mathematical model of PCR reaction.The predicted CT value of PE 7700 by the kinetic-mathematical model was in accordance with the real value detected by the machine.This kinetic-mathematical model accompanied by proper detecting equipment and computer could make an automatic PCR instrument,which would produce much better result.A laboratory can predict the amount of PCR product by this model and provide accurate information for further handling of PCR product according to its own condition.In this model,the molecular basis that PCR reaction is doomed to change from exponential amplification to linear amplification had been clarified.     

国家重点功能区转移支付对生态系统格局变化的县域对比分析

国家财政部于2009年印发了《国家重点生态功能区转移支付(试点)办法》,中央财政开始以转移支付的方式对国家重点生态功能区进行生态补偿,截止到2020年国家已累计下达转移支付资金6035.5亿元。评估国家重点功能区财政转移支付的生态保护成效对国家生态环境保护与修复决策具有重要意义,以国家重点生态功能区转移支付县域为调查和评估对象,基于多期遥感解译的土地利用/土地覆被数据,对正式实施财政转移支付政策以来国家重点生态功能区生态系统格局及其变化进行了评估,并对是否接受财政转移支付县域生态系统格局变化进行了对比分析。研究结果表明：国家重点生态功能区生态质量状况整体好转,2011—2019年土地覆被转类指数为3.85%,生态质量整体上好转主要与水域增加有关。享受国家财政转移支付政策后各县域生态质量改善明显,从2011—2016年的空间横向比较来看,享受财政转移支付县域土地覆被转类指数为2.28%,未享受县域为-3.36%;从2011—2019年的时间纵向比较来看,享受财政转移支付前土地覆被转类指数为-3.35%,而享受后为1.70%。然而,国家重点生态功能区人为活动干扰仍然较为强烈,研究时段内城乡...     

柑橘青霉菌CYP51B基因和上游调控区克隆及生物信息学分析

【目的】克隆柑橘青霉菌(意大利青霉菌,Penicillium italicum)CYP51的同源基因,并对基因序列进行生物信息学分析。【方法】通过PCR及染色体步移技术得到基因的完整序列及上下游调控序列。通过生物信息学手段对基因的结构进行分析:使用NNPP分析软件预测转录起始位点,并利用TFSEARCH1.3软件分析转录因子结合位点。利用SWISS-MODEL在线软件对蛋白进行同源模建。【结果】克隆得到了意大利青霉菌CYP51的同源基因,命名为Pi CYP51B。获得的Pi CYP51B及上下游调控区序列总长为3 496 bp,包括上游910 bp和下游834 bp的序列。Pi CYP51B基因的开放阅读框全长1 575 bp,编码524个氨基酸。该基因含有3个分别为74、51、52 bp的内含子,分别位于247 bp与320 bp之间,519 bp与569 bp之间,1 635 bp与1 686 bp之间。Pi CYP51B 5′上游调控区序列的总长为579 bp。生物信息学分析结果显示:转录起始位点位于上游458 bp处;上游调控区不仅包含启动子的核心结构序列TATA盒(位于-25 bp处),也包含多个转录因子结合位点,如Abd-B、ADR1、AP-4、GATA-1、Cdx A、Clox和Oct-1等。在上游调控序列中嘌呤含量高,而且从+387 bp处开始存在4个连续高嘌呤含量的热激转录因子特异性结合位点(HSF);在+106 bp处开始存在3个连续的Cdx A转录因子结合位点。选用人CYP51晶体结构(PDB ID:3LD6)为模板,利用SWISS-MODEL在线软件构建了意大利青霉菌CYP51B蛋白的结构模型。【结论】克隆了意大利青霉Pi CYP51B基因,其上游含有多个热激应答转录因子特异性结合位点(HSF)表明其参与逆境应答。该基因作为意大利青霉菌CYP51的同源基因,可能与青霉菌对真菌药物的抗药性密切相关。