工程菌种自动化高通量编辑与筛选研究进展

合成生物学(synthetic biology)与经典生物学研究的革命性区别之一是合成生物学能将生物实验的对象、方法、技术和流程高度标准化和模块化,创建出自动化与高通量的合成生物铸造模式。该模式通过复杂生物过程与自动化设施的结合,颠覆过往劳动密集型的研究范式,获得更高的技术迭代能力,极大促进了合成生物学的发展和产业化应用。值此天津工业生物技术研究所创立10周年之际,本文回顾了研究所在工业菌种自动化高通量编辑与筛选领域的系列重要工作进展,对基因克隆(gene cloning)、基因组编辑(genome editing)、编辑序列设计(editing sequence design)等生物技术的自动化实现,以及流式细胞、液滴微流控、全基因组规模扰动测序等高通量筛选技术进行了分析讨论,并展望了本领域未来的发展方向。望借此为创建具有自主知识产权的优秀菌种及其产业应用提供智能化、自动化和全链条覆盖的整体支撑能力。     

猪圆环病毒2型通过外泌体miR-125a-5p靶向Bcl-2诱导淋巴细胞凋亡

为研究miR-125a-5p在猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)诱导淋巴细胞凋亡中的作用及其作用机制,以PCV2感染PK-15细胞外泌体孵育的淋巴细胞为研究对象,采用流式细胞术、蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)和实时荧光定量PCR,检测淋巴细胞凋亡率及凋亡相关miRNA表达;合成miR-125a-5p模拟物和抑制物转染PK-15细胞,检测miR-125a-5p过表达或抑制表达后细胞凋亡率;采用生物信息学方法预测miR-125a-5p的靶基因,双荧光素酶报告基因检测miR-125a-5p对靶基因的调控;Western blotting检测外泌体孵育淋巴细胞的线粒体凋亡信号通路相关蛋白Bcl-2、Bax、细胞色素C和caspase-3的表达。结果显示,感染PCV2的PK-15细胞分泌的外泌体极显著提高淋巴细胞凋亡率,在一定浓度范围内呈剂量依赖性;与PCV2诱导细胞凋亡相关的miRNA中,miR-125a-5p表达量极显著升高,miR-125a-5p模拟物转染细胞后极显著提高细胞凋亡率;利用TargetScan预测发现,miR-125a-5p与Bcl-2 3''UTR区有结合位点,miR-125a-5p模拟物极显著抑制pmir-Bcl-2 3''UTR-WT荧光素酶活性,对pmir-Bcl-2 3''UTR-MuT的荧光素酶活性无明显改变;外泌体孵育的淋巴细胞Bcl-2表达量显著降低,Bax、细胞色素C的释放和caspase-3表达量显著升高,Bcl-2/Bax的比值极显著降低。这表明,PCV2通过外泌体诱导淋巴细胞上调miR-125a-5p的表达,进而抑制Bcl-2 mRNA和蛋白表达,激活淋巴细胞线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡。     

基于β-微管蛋白基因部分序列探讨灵芝属菌株的亲缘关系

PCR分别扩增了38个灵芝属菌株的β-微管蛋白基因片段,并对PCR产物进行序列测定,得到419bp的一段核苷酸系列.根据MEGA 2.1软件中的neighbour-joining methods对上述序列进行聚类分析,结果所有供试菌株被分成9个聚类组.中国栽培灵芝菌株分布于6个聚类组,其中树舌亚属、紫芝组的菌株各自聚成一组,灵芝组的菌株分成四组,但大部分灵芝组菌株均聚于同一组, 这表明树舌亚属、紫芝组和灵芝组间的遗传差异较大,灵芝组内虽然存在着一定的遗传差异,但总体上亲缘关系比较近,遗传多样性并不丰富.同时,序列分析的结果显示,β-tubulin基因序列在第三位密码子和内含子部位有高的碱基替换率,这些变异提供了丰富的系统发育信息,提示β-tubulin基因适合于灵芝属菌株的亲缘关系研究.     

固态混合发酵提高木聚糖酶和纤维素酶活力的研究

研究了接种比例、接种时间、碳源、氮源等因素对木霉和黑曲霉混合发酵产木聚糖酶和纤维素酶的影响。试验结果表明,当木霉和黑曲霉按4:6同时接种,以玉米芯3．75g、麸皮3．75g、葡萄糖37．5mg为混合碳源,Mandels营养盐11．5mL、添加NH_4NO_37．5mg为氮源,在84h产纤维素酶活力达到230IU/g干物质,木聚糖酶活力达到1308IU/g干物质,与两菌纯培养相比,纤维素酶活力提高163％,木聚糖酶活力提高79．5％。     

狸獭繁殖生理与人工授精技术的研究

人工受精技术已成为当代畜牧业重要技术手段之一,它能最大限度地发挥公畜种用价值,提高繁殖率,加速育种工作的速度,增殖和改良畜种,愈来愈受到世界各国的普遍重视.     

钙离子浓度对暗适应时的中华绒螯蟹光感受器超微结构的影响

用透射电镜研究了暗适应时中华绒螯蟹的光感受器超微结构与外界钙离子浓度的关系,结果显示出与培育在生理溶液中的光感受器相比,细胞外钙离子浓度升高,使得感杆束的直径急剧缩小,感杆束周围胞质增厚,胞饮泡增加,膜下猪泡囊极度减小。胞质中多囊体的数量和直径减小,而板模体和溶酶体的数量增加,同时细胞内的色素颗粒增多。分布在小网膜细胞的远端。细胞的结构表现为类似光适应状态,与之相反,细胞外钙离子浓度降低时小眼的感     

海南岛海水鱼类单殖吸虫研究Ⅴ——鲻鱼虫属一新种记述

在大鳞Ｌｉｚａｍａｃｒｏｌｅｐｉｓ鳃上检获到鲻鱼虫属１新种,小钩鲻鱼虫,新种ＬｉｇｏｐｈｏｒｕｓｈａｍｕｌｏｓｕｓＰａｎ＆Ｚｈａｎｇ,ｓｐ．ｎｏｖ．。以其后吸器两对中央大钩的形态结构以及背、腹中央大钩量度上的差异,背联结片的结构和交接器形态结构不同而区别于ＬｉｇｏｐｈｏｒｕｓｉｍｉｔａｎｓＥｕｚｅｔ＆Ｓｕｒｉａｎｏ,１９７７。     

东方百合"索邦"的花器官培养与快速繁殖

以东方百合"索邦"(Lilium orential "Sorbonne")的花梗、花托、花瓣和花丝为外植体,进行了离体培养与快速繁殖研究.结果表明,4种花器官均可直接诱导产生不定芽,诱导不定芽的适宜培养基为N6+ BA 1.0 mg·L-1 + KT 1.0 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1;芽增殖的适宜培养基为MS+BA 1.0 mg·L-1 + NAA 0.1 mg·L-1;生根与小鳞茎增殖的适宜培养基为1/2 MS+IBA 0.1～0.2mg·L-1.适宜的移栽基质为珍珠岩与营养土(3∶1)的混合基质.     

基于支持向量机的蛋白质同源寡聚体分类研究

基于支持向量机和贝叶斯方法,从蛋白质一级序列出发对蛋白质同源二聚体、同源三聚体、同源四聚体、同源六聚体进行分类研究,结果表明：基于支持向量机, 采用“一对多”和“一对一”策略, 其分类总精度分别为77.36%和93.43%, 分别比基于贝叶斯协方差判别法的分类总精度50.64%提高26.72和42.79个百分点.从而说明支持向量机可用于蛋白质同源寡聚体分类,且是一种非常有效的方法.对于多类蛋白质同源寡聚体分类,基于相同的机器学习方法（如支持向量机）,采用“一对一”策略比“一对多”效果好.同时亦表明蛋白质同源寡聚体一级序列包含四级结构信息.     

山羊品种间体细胞核移植研究

萨能奶山羊是著名的奶用山羊品种,波尔山羊则是世界著名的肉用山羊品种.为了研究波尔山羊体细胞在奶山羊卵母细胞中的去分化,我们将成年波尔山羊的颗粒细胞或耳皮肤成纤维细胞作为供核细胞(试验组),移入奶山羊中Ⅱ期的去核卵母细胞透明带下,经电融合和离子霉素与6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)激活,直接移入同期发情奶山羊输卵管或经体内培养,将发育的重构胚移人同期发情羊子宫内.妊娠早期作B超诊断,确立妊娠的观察至足月.同时将奶山羊的35日龄胎儿成纤维细胞作供核细胞(对照组),按试验组同样方法处理,将重构胚直接移入同期发情的奶山羊输卵管内.结果试验组,波尔羊颗粒粒细胞与耳皮肤成纤维细胞的融合率分别为78.2%(115/147)、57.4%(116/202),重构胚卵裂率为85.8%(115/134),桑椹胚、囊胚的发育率38.8%(52/134),早期妊娠三头,分别于妊娠40、60、60日龄终止妊娠.对照组,融合率为89.5%(136/152),早期妊娠率为42.9%(6/14),四头受体足月分娩,产四头公羊羔,其中三头存活,一头分娩时死于肺不扩张,并体重过大,显示胎儿过大综合症.经基因型鉴定证实,这四头克隆羔羊均源于同一胎儿成纤维细胞系.以上结果表明,波尔羊体细胞核在奶山羊卵母细胞中能够去分化,并维持一定程度的发育.