一种用于DNA甲基化分析的改进型亚硫酸氢盐转化法

DNA甲基化分析是认识生理、病理条件下基因表达变化的重要途径.亚硫酸氢盐转化是DNA甲基化分析的瓶颈.本文旨在改进琼脂糖 亚硫酸氢盐DNA处理方案(agarose bisulfite method),建立一种简便稳定、适合常规甲基化分析的亚硫酸氢盐转化法.把DNA包入普通琼脂糖,以饱和亚硫酸氢盐在较高的温度下快速处理,然后用离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,集DNA凝胶回收、脱盐、脱磺基和纯化于一体,完成整个转化过程.Bisulfite-PCR、克隆测序和酶切法分析转化率、转化特异性和转化物的质量.用该方案处理的HeLa细胞DNA,多个片段的转化率均大于98%,甲基化片段96.2%的CpG保持不变,可以扩增605 bp的较大片段,灵敏度介于普通法和琼脂糖亚硫酸氢盐法之间,而重复性较二者都好.改良后的方案简化了操作流程,快速稳定,易学易用,可实现高效特异转化,适合于一般实验者对常规检材进行DNA甲基化分析.     

固相微萃取-气质法测定土壤挥发性抑菌物质

运用固相微萃取．气相色谱,质谱法(SPME-GC／MS),测定了参与土壤抑真菌作用的土壤挥发性成分和土壤细菌挥发性代谢物。通过比较土壤来源和土壤细菌来源的挥发性抑菌成分,发现在强挥发性抑菌土壤和土壤细菌代谢物中普遍存在着三甲胺、二甲基二硫醚、3-甲基-2-戊酮、甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、N,N-二甲基辛胺、十九烷等化合物。这些化合物很有可能就是参与土壤抑菌作用,特别是挥发性物质抑菌作用的主要成分。另外,为深入了解土壤中参与抑菌作用的挥发性化合物提供了简便有效的方法。     

鲫鱼生长激素Ⅰ基因内含子2的多态性分析

利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Denaturing-Polyacrylamid Gel Electrophoresis,DPAGE)和单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism,SSCP)分析技术,在普通鲫鱼种群(7个野生鲫鱼群体和2个金鱼群体)和银鲫种群(1个方正银鲫群体)共162个个体生长激素Ⅰ(Growth HormoneⅠ,GHⅠ)基因的内含子2中检测到丰富的长度和序列多态性。在所有群体中,GHⅠ基因内含子2的长度存在7种类型,分别为A、B、c、D、E、F和G型,变异频率为4．32％;其序列存在15种单倍型,分别为Al、A2、A3、B、c1、C2、Dl、D2、D3、D4、D5、E1、E2、F和G型,变异频率为9．26%。对这15种单倍型的DNA序列进行分析,结果表明：1)鲫鱼GHⅠ基因内含子2的扩增DNA片段长为243～263bp,其中包括部分外显子2(3’端,33bp)、内含子2和部分外显子3(5’端,2lbp)。15种单倍型A、T、G、C碱基平均百分比组成分别为34．13％、37．36％、15．130A,、13．38％,其中G C(28．5l％)含量明显小于A T(71．49%)含量。内含子2与外显子2、3的接头区存在GT-AG保守序列,此为真核基因中mRNA剪接的识别信号。内含子2的5’端存在有一序列为GTAAGAT的保守区域,在其近3’端分布有一高丰度嘧啶区;2)内含子2的7种长度类型A、B、C、D、E、F和G型分别为189、196、204、205、206、207和209bp,其差异主要由单碱基T重复次数N不同(Ⅳ：0、8、9、10、11和13)和3种序列(TGAAAAC、TT和GAGTG)中1种或2种序列的缺失所引起;3)内含子2的15种单倍型的核苷酸序列中共有17个突变位点,包括2个碱基颠换突变位点和15个碱基转换突变位点,碱基转换突变频率为88．24％,明显高于颠换突变频率(11．76％)。普通鲫鱼种群中金鱼群体D11b、Dhr的GHⅠ基因内含子2均为长度类型A,含有两种序列单倍型(以下简称单倍型)即A1和A2;野生鲫鱼群体的内含子长度和序列变异较大,检测到A、B、C、D、E、F、G7种长度类型和14种单倍型(A1、A2、A3、B、C1、C2、D1、D2、D3、D4、E1、E2、F和G型)。在银鲫种群CaG中检测到c和D两种长度类型和4种序列单倍型(C1、C2、D2和D5),其中D5仅在此种群中检测到。     

短期速效胰岛素联合长效胰岛素强化治疗对初诊2型糖尿病患者胰岛功能及氧化应激的影响

目的：探讨短期速效胰岛素联合长效胰岛素强化治疗方案对初诊2型糖尿病患者胰岛功能及氧化应激的影响。方法：选择30例初诊2型糖尿病患者,在一般治疗的基础上,应用短期速效胰岛素联合长效胰岛素强化治疗方案进行治疗,检测并比较患者治疗前后一般血清指标包括空腹血糖（FBG）、餐后2小时血糖（2h PPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、血清C肽（FCP）,胰岛细胞功能指标包括胰岛素曲线下面积（AUG）、β细胞功能稳态模型评估（HOMA-B）、I30/G30、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、胰岛素及C肽水平,以及氧化应激指标包括丙二醛（MDA）及超氧化物岐化酶（SOD）。结果：（1）与治疗前相比,患者治疗后FPG、2h PPG、HbA1c、AUG、HomaB、HomaIR及I30/G30水平均显著改善,差异均有统计学意义（P均〈0.05）;患者口服糖耐量试验0h、1h及2h胰岛素水平及C肽水平均显著回升,差异有统计学差异（P〈0.05）。（2）治疗后,患者MDA水平显著降低,SOD水平显著升高,其差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：短期速效胰岛素联合长效胰岛素强化治疗方案可以明显改善初诊2型糖尿病患者胰岛功能,降低患者体内的氧化应激水平。     

昆明小鼠胚胎干细胞滋养层制备条件的实验研究

目的:建立小鼠胚胎成纤维细胞(MEFS)滋养层,用于昆明小鼠胚胎干细胞的培养。方法:取妊娠13.5的胎鼠,采用组织消化法分离培养出原代成纤维细胞,对MEFs的生长形态、生长曲线及分裂指数进行观察;MTT法筛选丝裂霉素C(MMC)作用的最佳浓度和时间;取妊娠3.5d的囊胚在经MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞集落生成情况。结果:MEFS为一种贴壁生长且增殖速度较快的细胞,第三代细胞增殖旺盛,第5代以后细胞开始变形并趋于衰老;MMC能抑制胚胎成纤维细胞的增殖,最佳的作用浓度和时间是10ug/ml作用2.5～4h,20ug/ml作用1-2.5h。妊娠3.5d小鼠囊胚在饲养层上培养能形成典型的"鸟巢"状干细胞集落,并可维持胚胎干细胞的正常形态且不发生分化。结论:这种方法制备的滋养细胞层适用于胚胎干细胞的培养。     

贵州重点地区土壤和水体中汞的生态风险

分析了贵州省土壤和地表水体中汞含量空间分布状况,分别采用地累积指数法和潜在生态危害指数法评价了土壤中的汞污染程度和潜在生态风险;采用单因子法表征了水体总汞污染程度,应用安全阈值法对水体活性汞和甲基汞进行生态风险评价.结果表明:贵州省汞矿区及涉汞行业毗邻区域土壤中总汞污染程度较高,涉汞区23个点位中严重污染、重污染和偏重污染水平分别占78.26％、13.04％和8.70％,且均为极度生态危害.非涉汞区除青山坡土壤中汞的生态风险极强外,其他区域土壤中汞的污染程度不高,生态风险属于可接受水平.贵州省汞开采与冶炼、铅锌冶炼、有机化工等行业已造成毗邻水体出现较严重的汞污染,且污染范围有扩大和延伸的趋势,但对水生生物有直接影响的活性汞和甲基汞的生态风险较小.     

乙肝肾患儿血清、肾脏和肝脏组织内乙肝病毒感染标志物的比较

目的:比较分析乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBV-GN)患儿血清、肾脏和肝脏组织内HBV感染标志物的表达情况。方法:45例血清HBV感染标志物阳性的HBV-GN患儿经肾脏组织活检确诊,其中13例同时进行肝脏组织活检,且行HBV感染标志物免疫组织化学检查。结果:45例HBV-GN肾脏病理改变为:膜性肾病(MN)25例(55.6%)、系膜增生性肾炎(MsPGN)11例(24.4%)、膜增生性肾炎(MPGN)5例(11.1%)、毛细血管内皮增生性肾炎(EPGN)4例(8.9%),免疫荧光检查显示肾脏组织内以IgG(40例,88.9%)和C3(34例,75.6%)沉积为主。血清HBV感染标志物HBeAg( )组25例(55.6%),HBeAg(-)组20例(44.4%);肾脏组织中HBcAg的阳性率为80.0%(36/45),其中,血清HBeAg(-)组肾脏组织HBcAg阳性率(100.0%)明显高于血清HBeAg( )组(64.0%),(P=0.002)。肝肾同检结果显示HBV感染标志物(HBsAg和HBcAg)在肝脏组织表达的阳性率分别为84.6%和53.8%,在肾脏组织表达的阳性率分别为84.6%和76.9%,且肝、肾组织中HBV感染标志物表达不同步。结论:HBV-GN患儿血清、肾脏和肝脏组织内HBV感染标志物表达呈明显的不一致性。     

瑞香属植物生物活性研究进展

瑞香属植物分布广泛,在我国有35种。其中一些种类自古即供药用、观赏和作造纸原料。近几十年来,人们已从瑞香属植物中发现了60多种具不同作用的生物活性物质。药理学和毒理学研究表明,这些活性物质中,有的抗HIV、白血病、血栓形成和动脉粥样硬化,有的可抑制铜绿假单孢菌、细菌和疟原虫感染,有的可用于临床引产,还有的具杀虫和抑菌作用。说明这是一个大有开发前途的植物类群。     

Expression of Arabidopsis acyl‐CoA‐binding proteins AtACBP1 and AtACBP4 confers Pb(II) accumulation in Brassica juncea roots

In Arabidopsis thaliana, the expression of two genes encoding acyl‐CoA‐binding proteins (ACBPs) AtACBP1 and AtACBP4, were observed to be induced by lead [Pb(II)] in shoots and roots in qRT‐PCR analyses. Quantitative GUS (β‐glucuronidase) activity assays confirmed induction of AtACBP1pro::GUS by Pb(II). Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) revealed that Pas elements in the 5′‐flanking region of AtACBP1 were responsive to Pb(II) treatment. AtACBP1 and AtACBP4 were further compared in Pb(II) uptake using Brassica juncea, a potential candidate for phytoremediation given its rapid growth, large roots, high biomass and good capacity to accumulate heavy metals. Results from atomic absorption analyses on transgenic B. juncea expressing AtACBP1 or AtACBP4 indicated Pb(II) accumulation in roots. Subsequent Pb(II)‐tracing assays demonstrated Pb(II) accumulation in the cytosol of root tips and vascular tissues of transgenic B. juncea AtACBP1‐overexpressors (OXs) and AtACBP4‐OXs and transgenic Arabidopsis AtACBP1‐OXs. Transgenic Arabidopsis AtACBP1‐OXs sequestered Pb(II) in the trichomes and displayed tolerance to hydrogen peroxide (H₂O₂) treatment. In addition, AtACBP1 and AtACBP4 were H₂O₂‐induced in the roots of wild‐type Arabidopsis, while lipid hydroperoxide (LOOH) measurements of B. juncea AtACBP1‐OX and AtACBP4‐OX roots suggested that AtACBP1 and AtACBP4 can protect lipids against Pb(II)‐induced lipid peroxidation.     

罗汉果全基因组Survey分析

罗汉果是广西特有药用及甜料植物,其主要成分之一甜苷V作为天然、非糖甜味剂,具有广阔的开发前景,但罗汉果目前完全来自于栽培,适生区狭窄,连作障碍严重,加之含量低导致甜苷V生产成本居高不下,严重限制了其应用。为了减少盲目性,在大规模全基因组深度测序之前,先做低覆盖度的基因组Survey测序,评价基因组的大小及复杂程度,以确定适合该植物全基因组的测序研究策略。该研究采用第二代高通量测序技术(Illumina Hiseq TM 2000)首次测定了罗汉果基因组大小,并利用生物信息学方法估计罗汉果杂合率、重复序列和GC含量等基因组信息。结果表明:(1)获得了18.1 Gb罗汉果基因组测序数据,基因组大小估计为344.95 Mb左右,测序深度为52×;(2)从K-mer分布曲线发现罗汉果基因组有明显的杂合峰,杂合率达1.5%,基因组高杂合导致组装的结果中Contig N50和Scaffold N50的长度比预期的要短很多,还造成GC平均深度及含量分布明显异常,存在一个低深度分布区域。基因组主峰后面有微弱的重复峰,说明罗汉果存在较多的重复序列;(3)由于罗汉果存在高杂合率和重复序列较多的特点,该基因组测序分析仅采用全基因组鸟枪法(WGS)策略不合适,为了更好地对全基因组进行序列拼接和组装,可尝试结合采用Fosmid-to-Fosmid或BAC-to-BAC策略。该研究结果对于揭示罗汉果产量、有效成分含量、发育及抗病虫的分子机制,以及通过分子育种来提高甜苷V含量和降低生产成本具有重要意义,为全基因组测序策略的选择提供了依据。