猪流行性腹泻病毒S蛋白胞内区线性B细胞表位最小基序鉴定

[背景] S蛋白是猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）的主要结构蛋白和免疫原性蛋白,在前期的研究中,本课题组在S蛋白的胞内区鉴定到2个包含线性B细胞表位的短肽。[目的] 鉴定PEDV S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序。[方法] 原核表达2个短肽的每次后移1个氨基酸的系列8肽,以兔抗S蛋白血清为一抗,通过Western Blot筛选阳性反应8肽,鉴定S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序。[结果] S蛋白胞内区的2个包含线性B细胞表位的短肽共享一个表位,该表位的最小基序为¹³⁷¹QPYE¹³⁷⁴。同源性分析显示该B细胞表位基序为保守性表位。[结论] 确定了S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序为¹³⁷¹QPYE¹³⁷⁴;S蛋白抗原表位的鉴定有助于提高对其结构和功能的理解。     

限制性内切酶Mlu I蛋白及其硒代衍生物的制备

【背景】限制性内切酶Mlu I是一种常用的工具酶,在分子生物学领域发挥着重要的作用,其三维结构尚未被解析。【目的】在大肠杆菌中克隆表达、纯化重组Mlu I蛋白及其硒代蛋白,并进行结晶条件的研究。【方法】构建重组表达载体pET28b-Mlu I,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化重组Mlu I蛋白和硒代Mlu I蛋白。对蛋白进行质谱检测、圆二色谱检测以及酶活检测,利用坐滴法进行结晶条件的筛选。【结果】构建了重组表达载体pET28b-Mlu I并纯化获得达到结晶纯度的蛋白,通过质谱检测确定硒代Mlu I蛋白中的8个甲硫氨酸全部被取代,结合酶活测试及圆二色谱检测确定了硒代对Mlu I蛋白的活性、结构无明显影响。采用坐滴法进行初步的晶体生长研究,重组蛋白目前已在1种条件下获得针状晶体并进行初步衍射,获得分辨率在0.32 nm左右的衍射数据。【结论】Mlu I蛋白及硒代Mlu I蛋白纯化体系的构建和结晶条件的研究,可为下一步解析Mlu I三维结构、作用机制的探讨及定向改造奠定基础。     

江西省2010年柯萨奇病毒A组24型变异株的全基因组序列分析

急性出血性结膜炎(Acute hemorrhagic conjunctivitis,AHC)是目前人类最常见的眼病之一,柯萨奇病毒A组24型变异株(Coxsackievirus A24 variant,CV-A24v)是近年来报道引起该病的主要病原体。本研究选取10株来自江西省2010年AHC暴发疫情的CV-A24v,采用特异性引物扩增并测定其全基因组序列。对该10条CV-A24v的全基因组序列进行系统发育分析以及重组分析,计算本研究测定的江西10条以及GenBank中所有22条CV-A24v的全基因组序列的氨基酸置换熵值,并预测其正向选择位点。结果表明,在江西10条CV-A24v基因组序列中未检测到重组。基于全基因组序列构建的最大似然树表明江西10株CV-A24v属于GIV基因型,且分处于两条传播链。对上述32条CV-A24v序列的氨基酸置换熵值计算,共得到25个易突变位点(熵值>0.6),易突变概率最高的区段为2A区。基于Datamonkey中FUBAR和FEL模型分析,发现位于结构蛋白VP2区的234位氨基酸为两种模型共同获得的CV-A24v的正向选择位点。本研究分析了江西10株CV-A24v的全基因组序列特征,为CV-A24v引起的AHC防控工作提供了基础资料。     

铁皮石斛WOX转录因子的鉴定和分析

为了解铁皮石斛(Dendrobium officinale) WOX转录因子的功能,采用全基因组分析技术对铁皮石斛WOX家族成员进行鉴定,并进行生物信息学和表达模式分析。结果表明,铁皮石斛基因组中有9个WOX转录因子(DoWOX 1～DoWOX 9),大部分的DoWOXs含有2～3个外显子,启动子含有与激素诱导、逆境胁迫和生长发育有关的顺式作用元件。qPCR分析表明,DoWOX1、DoWOX2、DoWOX3、DoWOX4和DoWOX9在类原球茎中的表达量最高,DoWOX4在小花蕾中表达最高,随着花的发育,表达呈现下降趋势。此外,DoWOX3、DoWOX7和DoWOX9在合蕊柱上的表达量最高,而DoWOX4在唇瓣的表达量最高。因此,DoWOXs可能参与调控铁皮石斛的生长发育,且可能在维持类原球茎状态和花的发育中起重要作用。     

益智不同组织多糖含量及其生物合成途径分析

为了解益智（Alpinia oxyphylla）多糖生物合成途径关键酶功能,对其茎、叶、果实中的多糖含量及其单糖组成进行了研究,并采用Real-Time qPCR分析了益智多糖生物合成关键酶基因的表达模式。结果表明,益智多糖含量依次为果实 > 叶 > 茎,主要由葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖组成;利用益智转录组数据共获得47 690条unigenes,其中31 892条在NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库获得注释,其中208个unigenes参与益智多糖的生物合成,涉及15个酶。表达分析表明,所筛选的18个基因在茎、叶、果实中均有表达,14个基因在果实中的表达量最高,以糖基转移酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达量最高,且其表达模式与不同组织中葡萄糖含量的变化一致。     

幼虫密度和温度对水芹叶象甲未成熟阶段生长发育的影响

[目的]为明确不同幼虫密度和不同温度条件对水芹叶象甲Hypera sp.未成熟阶段生长发育的影响.[方法]在室内条件下对不同幼虫饲养密度和不同温度条件饲养的水芹叶象甲未成熟阶段(卵、幼虫、预蛹和蛹)的存活和生长发育进行研究.[结果]幼虫密度对水芹叶象甲幼虫、预蛹和蛹的存活和生长发育均具有显著影响.水芹叶象甲幼虫、预蛹和蛹在50头/盒的密度条件下的存活率均显著高于其它密度条件,且发育历期显著短于其它密度条件.此外,各密度条件下的雌蛹重均显著重于雄蛹重,但性比(♀/♂)不受密度条件的影响.温度条件对水芹叶象甲卵、幼虫、预蛹和蛹的存活和生长发育亦均具有显著影响.27℃条件下的幼虫和蛹的存活率均显著高于其它温度条件,1龄幼虫在30℃条件下的存活率显著高于其它温度条件,而3龄幼虫在27℃条件下的存活率显著高于其它温度条件,但温度条件对2龄幼虫的存活率无显著影响.水芹叶象甲各龄期幼虫及各虫态的发育历期随着温度升高而显著缩短.[结论]幼虫饲养密度和温度是影响水芹叶象甲种群变化的重要因子,这将为分析水芹叶象甲种群动态变化规律,以 及提高该虫的预测预报和综合防控水平提供依据.     

毕赤酵母STE13基因敲除对GGH表达及其生物活性的影响

目的:重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-GGH表达的人胰高血糖素样肽-1-人血清白蛋白融合蛋白[(GLP-1 A2G)2-HSA,GGH]的细胞活性测评结果显示生物活性较低,这可能与其表达过程中蛋白降解有一定关联.通过对毕赤酵母GS115 STE13基因的敲除,获得一株完整表达蛋白GGH的毕赤酵母宿主,并进一步提高其表达产物GGH的生物活性.方法:采用基于PCR技术介导的Cre-Loxp系统重组技术成功敲除宿主菌GS115的STE13基因,得到一株STE13缺陷型菌株GS115/D13,并通过细胞活性测评系统检测GS115/D13表达产物GGH的生物活性.结果:通过对STE13基因缺陷型菌株GS115/D13与出发菌株GS115/W发酵表达对比,显示GS115/D13菌株表达融合蛋白GGH生物活性有明显提升,且表达量提高了25.8％,两菌株生长无明显差异.结论:STE13基因的敲除成功缓解了GGH表达过程中的降解问题,并相对出发菌株GS115/W大幅度提高了蛋白生物活性.     

猪流行性腹泻病毒经其附属蛋白抑制细胞凋亡

【背景】orf3位于猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) s基因与e基因之间,是目前发现的PEDV唯一一个附属基因,编码附属蛋白(ORF3蛋白)。我们前期研究初步发现ORF3蛋白对PEDV诱导的细胞凋亡有影响。【目的】研究ORF3蛋白在PEDV侵染复制过程中的毒力作用机制。【方法】实验用3种PEDV:rDR13att-?ORF3 (orf3基因全部敲除)、DR13-ORF3att (携带有C端截短orf3)、rDR13att-ORF3wt(携带全长orf3基因)感染Vero细胞,观察病变情况,再用活细胞成像仪、流式细胞仪、 DNA断裂的原位末端标记法[terminaldeoxynucleotidyltransferase(TDT)-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL]等方法检测不同感染时间点的细胞凋亡情况,然后用蛋白质印迹方法分析PEDV感染宿主细胞中主要凋亡相关蛋白(如Caspase-3)的活化或裂解,最后进行转录组测序研究病毒感染细胞中差异基因的表达情况,再用荧光定量PCR验证转录组结果。【结果】rDR13att-?ORF3引起较多的细胞病变,活细胞成像仪的动态观察结果显示,3种病毒侵染的细胞凋亡水平随着时间的延长均高于正常阴性细胞,但敲除orf3的病毒感染细胞后细胞凋亡率比其他两种病毒更高;敲除orf3病毒感染细胞凋亡率显著高于其他两种病毒;病毒rDR13att-?ORF3感染细胞后TUNEL阳性细胞数比DR13-ORF3att和rDR13att-ORF3wt更多;表达ORF3蛋白的重组PEDV可以抑制Caspase-3的活化;ORF3蛋白对受感染细胞Heat shock 70 kD protein 1B (HSP70)基因转录有促进作用,荧光定量PCR结果表明rDR13att-ORF3wt感染细胞的HSP70表达量高于rDR13att-?ORF3感染细胞。【结论】PEDV通过ORF3蛋白抑制细胞凋亡,而且这种作用可能是通过抑制Caspase-3的活化或增加HSP70的产生来完成的。     

葱蝇海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆、序列分析及滞育相关表达

海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase, TPS）是昆虫海藻糖合成途径中的关键酶之一。本研究通过对葱蝇Delia antiqua海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆、 序列分析及滞育相关表达的分析, 旨在证明该基因在能源合成以及抵御高温和低温环境方面发挥重要作用, 为进一步弄清葱蝇滞育分子机制提供理论依据。根据葱蝇抑制消减杂交文库中的EST序列信息, 设计特异性引物, 并通过RACE技术克隆了葱蝇海藻糖-6-磷酸合成酶基因全长cDNA, 命名为DaTPS1 （GenBank登录号： JX681124）, 其全长为2 904 bp, 开放阅读框2 448 bp, 编码815个氨基酸, 推测其相对分子质量为91.2 kD, 等电点为5.96。生物信息学分析表明, 该基因编码的氨基酸序列具有两个保守结构域, 与其他物种TPS具有较高的同源性, 其中和黑腹果蝇Drosophila melanogaster亲缘关系最近, 氨基酸序列一致性为92.1%; 其蛋白质三维结构有15条大的α螺旋和11股反向平行的β链折叠。RT-PCR分析表明, DaTPS1在葱蝇非滞育、 夏滞育和冬滞育期蛹中都有表达, 但是非滞育期各时期表达量基本没有变化, 而在夏滞育和冬滞育蛹的滞育前期表达量较高, 滞育保持期表达量较低, 滞育期后期表达量又有所升高。推断在葱蝇蛹夏滞育和冬滞育期前期, TPS1开始催化合成较多的海藻糖以提高滞育期抵御不良环境的能力, 滞育保持期蛹的新陈代谢降低, 所需能量较少, 所以TPS1处于低水平表达状态, 而滞育期结束后, 蛹生长发育逐渐恢复, 所需能量有所增加, TPS1的表达量再次升高。本研究对揭示昆虫TPS在能量代谢通路中的作用及昆虫滞育的分子机理具有一定的科学意义。