核酸杂交技术在微生物生态学上的应用

由于自然界中大部分的微生物种类到目前为止仍不可培养,传统基于培养和纯种分离的技术在研究微生物生态时面临很大障碍。分子生物学的进展为诸多长期困扰微生物学研究的问题提供了解决办法。核酸杂交技术已被证实在微生物系统分类和微生物生态等领域的研究具有巨大潜力并已被广泛应用。综述核酸杂交技术的基本原理、实际应用及其主要优点和局限性,以及提高其检测灵敏度和特异性的方法,并对该技术的应用前景作了探讨。     

一些化学和物理因素对羊瘙痒因子263K蛋白酶抗性的影响

朊病毒(prion)具有超强的理化因素抵抗能力,可抵抗常规物理和化学因子对其感染性的灭活.为了研究不同理化因素对PrPSc蛋白酶抗性的影响,采用不同浓度的NaOH、NaOCl、SDS、温度变化以及3%SDS与温度变化联合处理羊瘙痒因子263K,再经蛋白酶K(Proteinase K,PK)消化,通过Western blot检测观测PrPSc的PK抗性.结果发现,上述几种理化因素对羊瘙痒因子263K的PK抗性有不同程度的破坏作用.NaOH浓度在0.05mol/L以上,NaOCl游离氯含量在0.1%以上,温度在121℃以上都能使PrPSc的PK抗性消失;而1%～5%SDS不能使PrPSc的PK抗性完全消失,3%SDS与温度的联合作用可有效地破坏PK抗性,同时使所需温度降低.还发现,在较低浓度的化学因子或温度的条件下即可出现PK抗性的破坏,而在较高浓度或温度处理时才出现蛋白本身的消失.这些结果提示,与PrPSc感染性的结果相似,PK抗性可受相似浓度或强度的理化因素影响,具有明显的浓度或强度相关性,对判定消除PrPSc的感染性有一定的指导意义.     

氮磷添加对杉木林土壤碳氮矿化速率及酶动力学特征的影响

以江西杉木林红壤为研究对象,开展野外长期氮(N)、磷(P)添加控制试验,设置对照(CK)、N(50kg N hm~(-2)a~(-1))、P(50kg P hm~(-2)a~(-1))、NP(50kg N hm~(-2)a~(-1)+50kg P hm~(-2)a~(-1))处理,分析N、P添加对土壤碳矿化速率(C_(min))、氮矿化速率(N_(min))和相关的β-1,4-葡萄糖苷酶(βG)和β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶(NAG)动力学参数的影响。结果表明:(1)N添加明显降低了C_(min)和N_(min),比CK分别减少了25%和18%;N添加减小了NAG的潜在最大酶活性(V_(max))、半饱和常数(K_m)、催化效率(V_(max)/K_m),但差异不显著(P0.05);N添加显著增加了βG的V_(max)、K_m,但对V_(max)/K_m有抑制作用。(2)P输入(P、NP)较CK使NAG的V_(max)、K_m减小26%—60%;NP同时添加明显提高βG和NAG的V_(max)/K_m(P0.05),但P输入(P、NP)对C_(min)和N_(min)影响不显著(P0.05)。(3)C_(min)与土壤溶解性有机碳正相关,N_(min)与pH显著正相关,与土壤NH_4~+-N、NO_3~--N显著负相关;βG和NAG的V_(max)/K_m均与NH_4~+-N、NO_3~--N负相关(P0.05),K_m均与NH_4~+-N、NO_3~--N正相关(P0.05)。βG的V_(max)与NH_4~+-N、NO_3~--N正相关(P0.05),NAG的V_(max)与有机碳、全氮、全磷、有效磷负相关(P0.05)。研究结果表明,在亚热带杉木人工林中,N添加降低土壤pH,增加土壤有效氮含量,抑制βG和NAG的V_(max)/K_m,对土壤C_(min)和N_(min)产生抑制作用;而NP添加增加土壤有效磷含量,增加土壤βG和NAG的V_(max)/K_m。     

古尔班通古特沙漠生物结皮固氮活性

利用乙炔还原法对新疆古尔班通古特沙漠不同类型的生物结皮(藻结皮、地衣结皮、苔藓结皮)的固氮活性(nmolC2H4m-2h-1)进行了定量研究。结果表明,不仅采样时段和结皮类型对生物结皮的固氮活性具有显著的影响(p<0.05),二者的交互效应同样对生物结皮的固氮活性具有极显著的影响(p<0.01)。各类型生物结皮固氮活性变化趋势表现为:3～5月间,藻结皮(2.26×103)>地衣结皮(6.54×102)>苔藓结皮(6.38×102)。6～10月份,各类型生物结皮的固氮能力显著提高(p<0.05),藻结皮的固氮活性最高(9.81×103),依次为地衣结皮9.06×103、苔藓结皮2.03×103。11月～翌年2月间,月均温都低于0℃,抑制了生物结皮的固氮活性,藻结皮、苔藓结皮的固氮活性降幅极显著(p<0.01),分别低达4.18×102、5.43×102,地衣结皮降低至2.78×103。生物结皮成为古尔班通古特沙漠除豆科植物外重要的氮源,为该沙漠1年生浅根系草本植物的种子萌发与植物体的生长提供丰富的有机质源,从而有利于这些植物种群的繁衍与更新,并与之共同促进对沙面的固定。     

长期施肥对双季稻种植下土壤有机碳库和固碳量的影响

研究了长期施用化肥和猪粪(PM)、稻草(RS)对双季稻集约化种植下30年期间(1981-2010年)土壤有机碳(SOC)及其组分的影响.结果表明：化肥平衡施用处理(NPK)的SOC、颗粒有机C(POC)和KMnO₄氧化C(KMnO₄C)组分高于化肥非平衡施用处理(NP和NK);猪粪、稻草与化肥(NK+PM、NP+RS和NPK+RS)长期配合施用处理的SOC、POC和KMnO₄ C组分显著增加.连续种植30年60季水稻后,猪粪与NK配施处理0～45 cm土层的SOC(84.71 t C·hm^-2)、POC(8.94 t C·hm^-2)和KMnO₄ C(21.09 t C·hm^-2)数量最高,其次是NPK+RS处理;NK+PM处理(485 kg C·hm^-2·a^-1)的固C量最高,其次是NPK+RS处理(375 kg C·hm^-2·a^-1).化肥与猪粪、稻草配施处理SOC的固C效率(CSE)明显高于单施化肥处理;施肥处理POC的固C效率(0.4%～1.2%)低于KMnO₄C(3.0%～8.3%).采用腐殖化常数值(h)和Jenkinson方程的衰减常数(k)可以预测不同处理2010年的SOC储量,通过Jenkinson方程可以计算维持1981年的SOC储量水平所需要的C投入量(A_E).双季稻种植下,长期连续施用NK+PM、NP+RS和NPK+RS处理的SOC含量增加是由于年C输入量高于A_E所致.在南方亚热带双季稻种植区,化肥与猪粪、稻草长期配施将促进水稻土有机碳的固定.     

人乳头瘤病毒(HPV)58型DNA疫苗免疫原性的初步分析

为了检测HPV 58型不同L1基因的DNA疫苗的免疫原性,以pcDNA3.1为载体分别构建含HFV 58型不同L1基因的DNA疫苗,命名为L1h、L1h△c、L1S、L1SM和L1wt.用免疫印迹法检测各DNA疫苗的体外表达情况;各重组质粒与pcDNA3.1-h58L2和pcDNA3.1-GFP共转染293FT细胞,检测其形成假病毒的能力;并将各DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠,利用假病毒中和实验检测中和抗体水平,用ELISPOT检测细胞免疫情况.结果显示,本实验成功构建了五种DNA疫苗,L1h△c的体外表达量最高,L1S和L1SM的表达量次之,L1wt没有表达;重组质粒L1S能够形成假病毒,而其他四种重组质粒均不能形成假病毒.L1S和L1h均可在小鼠体内诱导中和抗体,但L1S诱导的中和抗体的平均滴度为1:6 400,明显高于L1h诱导的中和抗体水平(平均滴度为1:48),而其他疫苗在小鼠体内未产生中和抗体.对五种疫苗均未检测出特异性的细胞免疫反应.结果提示,体外能够组装成假病毒的DNA疫苗在免疫动物后可诱导高滴度的中和抗体,为今后DNA疫苗的筛选提供参考.     

苜蓿银纹夜蛾多核衣壳核型多角体病毒AcMNPV P78/83蛋白初步研究

AcMNPV ORF9编码病毒核衣壳蛋白P78/83,该蛋白在宿主细胞内以磷酸化和去磷酸化两种形式存在,能够与细胞骨架成分肌动蛋白相互作用,序列分析表明其具有与WASP蛋白类似的结构,推测可能在病毒粒子的包装、运输等过程中起重要作用.本文利用Bac-to-Bac系统构建了P78/83与绿色荧光蛋白融合表达的重组AcMNPV,激光共聚焦显微镜观察表明,重组病毒感染Sf21细胞12h后绿色荧光主要集中分布于细胞质中,24h及以后绿色荧光主要集中分布于细胞核中.感染试验表明,超表达P78/83对病毒的生长无明显的影响.     

高通量测序技术及其在表观遗传学上的应用

DNA测序技术是现代生命科学研究的重要工具之一,而高通量测序技术在全基因组的研究中发挥着越来越重要的作用。简要回溯DNA测序技术的产生与发展,着重从PCR扩增测序和单分子测序两个方面全面描述了高通量测序中众多代表性的技术及直接测序技术,并从DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控等方面阐述了高通量测序技术在表观遗传学上的运用。     

HIV-1膜抗原部分位点的改造对假病毒形成及感染能力的影响

研究HIV-1膜抗原部分位点的改造对假病毒形成及病毒感染能力的影响。本实验采用环形诱变和DpnΙ筛选的方法对env进行定点突变。用获得的克隆和骨架质粒pSG3△env共转染293FT细胞,收获假病毒后用TZM-bl细胞进行单周期感染试验,检测特定位点改造对功能性假病毒形成能力的影响。改造之前样品S12-42-1的免疫印记的实验结果显示弥散的条带,蛋白大小约160kD,但单周期感染试验中其S/CO(样品信号值与临界值的比值)小于1,即不能形成假病毒。将该样品第457位氨基酸由丙氨酸变成天冬氨酸后,用突变体S12-42M进行单周感染试验,其S/CO值为6.65,表示突变体能够形成假病毒。结果表明HIV-1膜抗原部分位点的改变影响假病毒的形成或假病毒感染细胞的能力。     

基于单细胞转录组的视网膜母细胞瘤进展特征分析

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB）是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤。在RB进展过程中的关键致病因素目前尚不十分清楚。因此,识别与RB进展密切相关的基因能为病情诊断及基因治疗提供重要信息。然而,肿瘤组织具有很强的细胞异质性,不同病理状态下的细胞,其功能及基因表达都可能呈现显著的差异。本研究从公共基因表达数据库（gene expression omnibus,GEO）下载了1例4个月肿瘤患者和1例2年患者的肿瘤及癌旁组织的单细胞转录组测序数据,从单细胞水平解析不同患病时长的RB肿瘤转录图谱,鉴定与RB进展有潜在关联的细胞亚群及基因集。结果显示,肿瘤组织与癌旁组织在单细胞转录图谱上具有整体的一致性,但视锥前体G1期细胞群、G2期细胞群以及小胶质细胞群在肿瘤与癌旁组织中的分布比例存在明显差异。进一步分析了这3种细胞群在RB肿瘤进展过程中的作用。研究发现,在RB肿瘤的早期阶段,视锥前体细胞在G1期异常增殖,随着RB肿瘤的进展,视锥前体G2期细胞比例显著增加。同时,RB进展过程的小胶质细胞群差异分析结果显示,主要参与免疫应答的关键基因包括RPL23、B2M、HLA家族基因。本研究可为RB发病机制及进展研究提供更多新视角和数据资源。