热稳定性伯克霍尔德菌脂肪酶A突变体的筛选

摘要:【目的】为更好地提高伯克霍尔德菌ZYB002脂肪酶LipA在TMP纸浆造纸工艺中的应用,有必要利用蛋白质工程技术,提高其热稳定性。【方法】基于B-factor值筛选LipA多肽链中潜在的突变位点,利用迭代饱和诱变技术,构建突变文库,筛选热稳定性提高的突变体。【结果】利用上述方法,从4个突变文库中分别筛选到在55℃下,半衰期较野生型脂肪酶LipA分别提高了1.8倍、3倍、2.2倍和1.7倍的脂肪酶突变体。【结论】基于B-factor值选择突变位点,利用迭代饱和突变技术,快速筛选到热稳定性有显著提高的突变体。     

大豆下胚轴可溶性蛋白中钙激活的蛋白激酶

大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍ ａｘ Ｌ．） 下胚轴可溶性蛋白提取液进行自磷酸化,以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析其标记产物时发现,当有较高浓度的Ｃａ２＋ 存在于反应液中时,有一条１８ ｋＤ蛋白带被高强度标记,同时也可观察到另一条标记强度不高的６７ ｋＤ蛋白带． 当反应时间延长到１５ 或３０ｍ ｉｎ 时,它们的标记强度都逐渐减弱,最终从放射自显影底片上消失;在反应液中加入钙螯合剂ＥＧＴＡ 时,则只有６７ ｋＤ 被高强度标记;在磷酸化反应过程中加入非标记ＡＴＰ,蛋白中的３２Ｐ逐渐被非标记磷取代,表明反应体系处于磷酸化－脱磷酸化的平衡过程中,并有结果显示这一过程是钙依赖性的． 组蛋白Ｈ１ 可以使反应进程加快,表明提取液中的蛋白激酶可以利用它作为底物． 综合结果表明,１８ ｋＤ和６７ ｋＤ蛋白可能是具有自磷酸化能力且对Ｃａ２＋ 敏感的蛋白激酶,它们对Ｃａ２＋ 的不同反应,使得钙信号的传递更具可控性     

Rb、P53调控平滑肌细胞c-fos和c-jun基因表达

为研究外源性Rb和P53基因导入血管平滑肌细胞后对c-fos和c-jun基因表达的调控作用,将Rb基因或P53基因重组腺病毒载体转染人脐动脉血管平滑肌细胞,应用RT-PCR和免疫组化法检测c-fos、c-jun的mRNA及蛋白质表达水平,以DNA琼脂糖凝胶电泳和β-半乳糖苷酶染色分别观察细胞凋亡和细胞衰老.结果显示,野生型P53基因导入可诱导平滑肌细胞凋亡,c-fos和c-jun mRNA及蛋白质表达水平显著增高.外源性Rb基因导入能促进细胞衰老,下调c-fos基因表达,但对c-jun基因表达没有明显影响.     

β-葡萄糖苷酶的分离纯化和性质研究

β－葡萄糖苷酶是纤维素酶的重要组分之一,它不仅可水解纤维二糖和寡糖,更可解除纤维二糖对β－１,４－内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的抑制,提高水解速率和程度．利用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０和ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０层析法从黑曲霉变异株Ｌ－２２中分离提纯了β－葡萄糖苷酶,该酶是由两个分子量相同的亚基组成的二聚体,每个亚基分子量为２０３ｋＤ．该酶最适ｐＨ为４．８,ｐＨ稳定范围在３．６～６．４;最适温度是６０℃,温度稳定范围为４～６０℃;酶分子含糖量为８．３５％．它是一个酸性β－葡萄糖苷水解酶,专一性地水解β－糖苷键．而不水解α－糖苷键,对短链底物表现了相对高的活力．用动力学分析和共价化学修饰方法探讨了与该酶活力有关的必需基团．由ｐＨ对ｌｇＶｍ和ｌｇＶｍ／Ｋｍ的影响,推测出酶活性部位至少有两个可解离基团为酶活性所必需,它们在酶－底物复合物中的ｐＫｅｓ１和ｐＫｅｓ２的值分别为４．０和５．６,在游离酶中的ｐＫ值分别为４．２和５．９．由此可初步判断这两个可解离基团可能为组氨酸和含羧基的氨基酸,它们与酶的催化和底物结合可能有关．     

口服草原兔尾鼠卵透明带3纳米乳剂DNA疫苗免疫效果研究

用免疫不育疫苗控制有害动物的数量成为动物种群数量控制的一个有效措施,对于大多数动物来说．口服饵料发送系统是最好的选择。但是口服疫苗容易产生耐受,且生物利用度低,利用多聚物包裹口服疫苗是一种打破口服耐受．提高其生物利用度的新途径。本文以纳米乳剂作为草原兔尾鼠卵透明带3（Lugurus zone pellucida 3,LZP3）DNA疫苗的发送载体,探讨通过口服途径增强小鼠的免疫效果和抗生育率。用纳米乳剂包裹lzp3 DNA疫苗后,采用强阴离子交换色谱法测定纳米乳剂的包封率．将制备好的质粒纳米乳剂lzp3 DNA疫苗通过口服饵料免疫小鼠,检测到免疫后小鼠的体内产生了特异性的抗LZP3的IgG和IgA。对免疫后小鼠进行抗生育实验,分析生育后免疫小鼠的卵巢病理切片。研究结果表明,用质粒纳米乳剂如p3DNA疫苗通过口服途径免疫．在小鼠的血清和粘液中检测到了特异性的抗LZP3的IgG和IgA,同时也产生了相应的抗生育作用．表明纳米乳剂作为口服不育疫苗的发送载体是可行的,为草原兔尾鼠鼠害的防治提供了理论基础．     

脉冲电场对真皮成纤维细胞生长和膜流动性的影响

采用MTT比色分析法检测脉冲电场(f=50Hz,t=20μs,Epp=1V/m),对真皮成纤维细胞增殖的影响,结果表明,电场作用1分钟和5分钟,均产生促进细胞增殖的效果(P<0.05和P<0.001),而较长时间(t≥10分钟)的电场作用则显著抑制细胞的正常增殖(P<0.001)。 采用荧光偏振法研究了脉冲电场对真皮成纤维细胞膜流动性的影响。结果表明,电场作用5分钟后即刻引起膜流动性的显著增加。而电场作用45分钟后,需经过一段时间的温育(30 分钟),才表现出膜流动性的降低。说明不同作用时间的电场可以造成膜流动性的增加或降低,而且对膜流动性的影响是可逆的。我们认为,脉冲电场所引起的膜流动性改变是细胞分裂能力发生变化的原因之一。     

荷叶碱对bel-7402细胞胆固醇代谢的影响

目的:探讨荷叶主要单体成分荷叶碱对Bel-7402细胞株胆固醇吸收、合成及酯化的影响。方法:体外培养Bel-7402细胞株,待细胞长满80%后无血清培养基饥饿细胞24h,分别加入1uM、10uM、100uM的荷叶碱及10uM的阿托伐他订,实时定量PCR和Western blotting法分别检测给药24小时后细胞内低密度脂蛋白受体(LDLR)、β-羟β-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)、酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT)的基因表达和蛋白质水平。结果:与对照组相比,荷叶碱各剂量组均能明显升高LDLR、HMGCOAR基因表达及蛋白水平,且呈剂量依赖性(P<0.01),阿托伐他汀组LDLR、HMGCOAR基因表达及蛋白水平高于荷叶碱各组(P<0.01),荷叶碱、阿托伐他汀均能降低细胞内ACAT基因表达及蛋白含量,荷叶碱中剂量组ACAT基因表达及蛋白含量均高于阿托伐他汀组(P<0.01,P<0.05),荷叶碱高剂量组ACAT基因表达高于阿托伐他汀组(P<0.05),蛋白水平两组没有显著性差异。结论:荷叶碱可能是通过抑制细胞内胆固醇的合成、抑制胆固醇酯酶的活性及升高低密度脂蛋白受体的量而起到降血脂作用。     

OsGRF4 controls grain shape,panicle length and seed shattering in rice

Traits such as grain shape, panicle length and seed shattering, play important roles in grain yield and harvest. In this study, the cloning and functional analysis of PANICLE TRAITS 2 (PT2), a novel gene from the Indica rice Chuandali (CDL), is reported. PT2 is synonymous with Growth‐Regulating Factor 4 (OsGRF4), which encodes a growth‐regulating factor that positively regulates grain shape and panicle length and negatively regulates seed shattering. Higher expression of OsGRF4 is correlated with larger grain, longer panicle and lower seed shattering. A unique OsGRF4 mutation, which occurs at the OsmiRNA396 target site of OsGRF4, seems to be associated with high levels of OsGRF4 expression, and results in phenotypic difference. Further research showed that OsGRF4 regulated two cytokinin dehydrogenase precursor genes (CKX5 and CKX1) resulting in increased cytokinin levels, which might affect the panicle traits. High storage capacity and moderate seed shattering of OsGRF4 may be useful in high‐yield breeding and mechanized harvesting of rice. Our findings provide additional insight into the molecular basis of panicle growth.     

前噬菌体

随着微生物基因组测序工作的广泛展开,前噬菌体在宿主菌基因组中普遍存在的事实已逐渐为人们所接受.相关研究工作的深入揭示前噬菌体并不只是细菌体内一个简单的寄生体,相反是细菌生理活动相当活跃的参与者,在宿主菌生命活动中发挥着重要的作用.对前噬菌体的深入了解将丰富人们对多种生命现象的认识.本文即是关于前噬菌体的分类、分布、鉴定、进化及其与宿主菌相互作用等知识点的一个简单综述.     

SARS—CoV N蛋白与病毒mRNA相互作用的初步研究

SARS冠状病毒(SARS-CoV)是一种新型的冠状病毒,其基因组大小约为30,000 nt,为单股正链RNA。病毒基因中的1-72个核甘酸为前导序列。核衣壳(Nucleocapsid,N)蛋白是冠状病毒的主要结构蛋白,它在病毒基因转录,翻译以及病毒颗粒包装中起重要作用。在本研究中,我们通过PCR的方法从SARS-CoV cDNA中克隆N基因,将基因克隆到大肠杆菌表达载体中,经表达纯化获得大量重组蛋白,通过亲和层析和凝胶过滤层析获得高纯度的N蛋白。同时构建前导RNA的转录模板,经体外转录得到地高辛标记的RNA。使用Northwestern分析技术,我们证实纯化的N蛋白在体外可以与RNA发生特异性的结合。N蛋白与病毒RNA的结合特性及其在病毒生活周期中的所起作用的初步研究,为下一步设计出有效的阻断病毒周期从而达到抗病毒目的的药物或疫苗奠定了基础。