枯草芽孢杆菌JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分离纯化

枯草芽孢杆菌JA分泌物中具有抑菌作用的粗提液通过DEAESepharose FF、SOURCE 15 PHE、Sephacry1 S200HR和反相HPLC多步柱层析分离纯化后,获得3种对水稻纹枯和小麦赤霉病菌均有抑菌作用的抗菌肽AFP1、AFP2和AFP3。MALDITOF质谱法测得其分子量分别为1462.645D、1476.390D和1490.530D。氨基酸组成分析结果表明,AFP1和AFP3由苏氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸等多种氨基酸组成。目标产物热稳定性好、对蛋白酶有一定的耐受性,推断很可能是低分子量的环状脂肽。     

Following the recovery of naso-pharyngeal cancer patients by trace elements in hair using statistical pattern recognition methods

This article describes a study where the recovery of nasopharyngeal cancer (NPC) patients was traced by trace elements (TEs) in hair of these patients. These patients whose concentrations of TEs in hair were studied are volunteers who were divided into three groups B, C, and D. Group B was made up of volunteers who had just been diagnosed as having NPC, group C and group D were made up of volunteers who had been diagnosed as having NPC after 3 and 6 mo, respectively, of treatment. For comparison, a control group, namely group A, which was made up of volunteers from healthy persons was added to this study. By implementation of statistic pattern recognition methods, it has been found that the concentrations of TEs in hair can remarkably reflect different recovery phases of NPC patients.     

假单胞菌Pseudomonas fluorescens Pf0-1中转录调控因子SpfB负调控DNA磷硫酰化修饰

[目的]DNA磷硫酰化修饰是DNA骨架上非桥接的氧原子以序列选择性和R-构型被硫取代的一种新型DNA修饰。目前,磷硫酰化修饰在多种细菌、古生菌以及人类致病菌中多有发现,但其分子调控机制尚不清楚。为了全面解析磷硫酰化修饰的调控机制,本文选择荧光假单胞菌Pf0-1为研究对象,开展了其DNA磷硫酰化修饰的调控机制研究。[方法]首先,构建了spfB基因缺失和回补菌株,使用碘能特异性断裂磷硫酰化修饰DNA的方法,研究了该基因缺失对修饰表型的影响。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR,确定了磷硫酰化修饰基因簇spfBCDE内的共转录单元。通过荧光定量RT-PCR,分析了spfB基因缺失突变株中磷硫酰化修饰基因的转录量。利用异源表达并纯化得到的重组蛋白SpfB进行了体外功能研究。通过EMSA实验,验证了SpfB蛋白具有与spfB启动子序列结合活性。通过DNase I footprinting实验,精确定位了SpfB蛋白与DNA结合序列。[结果]spfB基因的缺失加剧了磷硫酰化修饰DNA断裂所致电泳条带弥散的表型,spfB基因的回补能够恢复该表型,证明spfB基因负调控磷硫酰化修饰。鉴定了spf基因簇中只含有1个共转录单元,且该共转录单元在△spfB突变株中转录水平明显上升。通过EMSA和DNase I footprint实验,检测了SpfB蛋白与磷硫酰化修饰基因spfBCDE的启动子区域5''-TGTTTGT-3''相结合。[结论]SpfB作为转录调控因子负调控磷硫酰化修饰基因spfBCDE的表达,为解析磷硫酰化修饰的调控机制和全面理解基因组上的部分修饰特征奠定了基础。     

一株产蓝色素菌株生物学特性及色素基本性质的研究

对一株从土壤中筛选的产蓝色素链霉菌-ZLT菌株进行了生物学特性和色素基本特性的研究。根据其形态、培养特征和生理生化特性分析,该产蓝色素菌株为链霉菌属,命名为链霉菌-ZLT。与现有报道的放线菌蓝色素相比,该色素纯度较高,无毒副作用,初步认为该色素为一种新的天然蓝色素。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析

选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种 (subsp. Leesis) 菌株YBT833、鲇泽亚种(subsp.Aizawai) 菌株YBT-1416和库斯塔克亚种(subsp. Kurstaki)菌株YBT1535为出发菌株,以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针,进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位。结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因,均位于经XbaI完全消化的4～5kb大小的DNA 片段上。将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体,建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库。通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15,并对其测序。DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基。将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌大肠杆菌穿梭载体pHT315, 分别得到重组质粒pBMB8901和pBMB8902。将它们电转化到vip^-的B.t.受体菌BMB171和4Q7,获得了相应的工程菌BMB8901-171,BMB8902-171,BMB8901-4Q7和BMB8902-4Q7。SDS-PAGE电泳检测均有88kD大小的蛋白表达。生物测定结果亦表明了,营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性;其中对小菜蛾的毒力最高,LC₅₀值分别为28.6,31.6,45.4和37.6μL/mL。该结果为构建高效广谱工程菌提供了实际材料和理论依据。      

Tat-MANF融合蛋白的制备及生物活性研究

目的：构建用于表达具有Tat序列的新型神经营养因子MANF（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor）融合蛋白（Tat-MANF）的重组质粒;利用原核细胞表达系统表达该重组蛋白,并检测其生物学活性。方法：以MANF cDNA为模板,利用PCR技术在上下游分别添加TAT序列和His标签及合适的限制性酶切位点,构建TAT-MANF融合基因。插入表达载体Pet22b⁺后,转化大肠杆菌BL21进行表达和纯化,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达的重组蛋白。为了验证Tat-MANF的生物学活性,用30μmol/L浓度的6-羟多巴胺（6-OHDA）对神经母胶质瘤细胞（SH-SY5Y）进行毒性诱导,同时加入2μg/ml的TAT-MANF及对照MANF蛋白,24h后用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。用脑微血管内皮细胞（B-endo3）体外模拟血脑屏障,与FITC标记的Tat-MANF共孵育4h,荧光显微镜下观察。结果：成功构建TAT-MANF融合基因,表达产物与目的蛋白大小相符,能与MANF抗体发生结合反应。重组蛋白可减少由6-OHDA导致的SH-SY5Y细胞凋亡,Tat-MANF-FITC与B-end3细胞共孵育4h后,可见细胞内明显荧光。结论：获得的重组蛋白Tat-MANF具有神经细胞保护作用及跨膜功能,为进一步开展帕金森症的体内治疗研究奠定了物质基础。     

紫茎泽兰的化学成分初报

紫茎泽兰(Eupalorium adenophorum Spreng)原产中美墨西哥,现在滇南一带广泛分布,对林、牧业生产造成严重危害。其化学成分研究未见报道。 从紫茎泽兰的叶和花序中,分到九个单体,经详细的光谱解析和与标准品对照,其中五个成分的化学结构分别为:正三十二烷n-dotriacontane(1),β-谷甾醇β-sitosterol(2),豆甾醇stigmasterol(3),蒲公英醇棕榈酸酯taraxasteryl palmitate(4),蒲公英醇乙酸酯taraxastcryl acetate(5)。     

地塞米松与硫酸镁对大鼠小肠缺血再灌注损伤的作用及机制

目的研究地塞米松和硫酸镁对大鼠小肠缺血再灌注（I/R）损伤的保护作用,并初步探讨其机制。方法制作小肠I/R模型,实验分为假手术阴性对照组、I/R组、硫酸镁治疗组、地塞米松治疗组、地塞米松和硫酸镁联合治疗组,比较五组血浆二胺氧化酶（DAO）、丙二醛（MDA）的含量,同时比较小肠的病理切片观察治疗效果。结果①I/R组小肠组织病理变化明显,血浆DAO、MDA比假手术阴性对照组显著升高;②硫酸镁治疗组和地塞米松治疗组小肠病理变化减轻,血浆DAO、MDA比I/R组显著降低,且两组无显著差别;③硫酸镁和地塞米松合用组的血浆MDA比I/R组显著升高,但是小肠病理变化和I/R组相比无明显区别,血浆DAO也和I/R组无明显差别。结论硫酸镁,地塞米松分别对大鼠小肠缺血再灌注有保护作用而二者合用却无明显的保护作用。     

鱼腥藻PCC7120藻蓝蛋白α亚基体内重组研究

为了研究藻蓝蛋白α亚基的生物合成途径,通过构建相容的3种重组质粒pETDuet-cpcA、pCOLADuet-cpcE-cpcF和pACYCDuet-ho1-pcyA,将裂合酶基因cpcE和cpcF、血红素氧化酶基因ho1、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和脱辅基藻蓝蛋白α亚基基因cpcA共同转入大肠杆菌BL21(DE3)。通过色素蛋白锌电泳和光谱检测表明产生了生物活性的CpcA-PCB。成功实现了大肠杆菌内藻蓝蛋白α亚基84位半胱氨酸残基与PCB的连接。而在裂合酶基因cpcE和cpcF不转入大肠杆菌的情况下,大肠杆菌内只有0.2%的CpcA-PCB产生。以上研究为进一步在大肠杆菌内合成天然的藻蓝蛋白奠定了基础。     

带内含子卡那霉素抗性基因双元载体构建及烟草转化

农杆菌介导法是植物基因转化的常用方法,然而由于筛选培养基中常用的抗生素头孢霉素和羧苄青霉素具有类植物激素活性,影响外植体的再生和转化频率。将一个植物的内含子插入卡那霉素抗性基因编码区的N端,合成了一个带内含子的卡那霉素抗性基因。构建带该基因的植物双元表达栽体pYP1202并转化烟草,受侵外植体在含卡那霉素50～200mg/L的选择培养基中抗性芽分化频率不受卡那霉素浓度影响,然而具有GUS活性的转化子占分化芽的比例却随着卡那霉素浓度的增加而升高。当培养基中加入500mg/L羧苄青霉素后受侵外植体产生的抗性芽频率比单一的卡那霉素筛选提高近1倍,高达91.4％,然而具GUS活性的转化子占抗性芽的比例仅有26.7％,在200m/L的卡那霉素筛选下,比例升至93.3％。用带内含子卡那霉素抗性基因构建的植物表达载体转化植物可以减少假抗性芽的产生。