家蚕细胞色素P450基因Bmcyp6u1的克隆、序列分析与表达谱

细胞色素P450第6亚家族基因为昆虫所特有,与抗性相关。为了检测家蚕Bombyx mori cyp6u1基因是否与耐氟性相关,首先克隆了cyp6u1基因。采用生物信息学方法获得与黑腹果蝇Drosophila melanogaster cyp6u1基因同源的家蚕B. mori cyp6u1基因序列, 预测该序列的开放阅读框（ORF）为1 476 bp, 编码491个氨基酸, 推定的蛋白质分子质量为56.15 kD, 等电点为9.23。以家蚕5龄第3天幼虫精巢cDNA为模板, 设计特异引物PCR扩增出一条约1 500 bp的条带, 大小与家蚕cyp6u1序列的ORF预测值接近, 命名为Bmcyp6u1基因（GenBank登录号：HM130560）。同源性分析表明, Bmcyp6u1基因与蜜蜂Apis mellifera的同源基因cyp6AS13的相似性为56%, 与拟南芥Arabidopsis thaliana的cyp72A82的相似性为48%, 与人Homo sapiens的cyp3A7基因的相似性为50%。芯片数据分析表明, Bmcyp6u1基因在家蚕5龄第3天幼虫各组织表达量很低, 只在精巢组织(5龄第3天)稍有表达, 推测该基因具有组织特异性。     

黑土微生物呼吸及群落功能多样性对温度的响应

采用室内培养法,研究了梨树(43°20′N,124°28′E)、德惠(44°12′N,125°33′E)、海伦(47°26′N,126°38′E)和北安(48°17′N,127°15′E)黑土在4℃、15℃和28℃培养条件下的土壤微生物呼吸及Biolog代谢功能多样性.呼吸试验结果表明:尽管土壤微生物呼吸速率在不同培养温度下均表现为北安海伦德惠梨树,但呼吸温度敏感性(Q10值)却随培养温度不同而产生分异,在4℃到15℃变化区间,梨树、德惠、海伦和北安土壤的Q10平均值分别为2.72、3.26、3.21和3.74,而在15℃到28℃变化区间,Q10平均值分别为3.29、2.36、2.11和1.79.不同样点土壤微生物呼吸熵(qCO2)也随培养温度不同而不同,qCO2值在28℃条件下为梨树德惠北安海伦,在15℃条件下为北安德惠海伦梨树,而在4℃条件下样点间变化不大.Biolog试验结果表明:在4℃条件下,微生物群落底物利用碳源数和代谢Shannon指数以海伦和北安黑土较高,而在15℃和28℃条件下,则以梨树和德惠黑土较高.主成分分析表明,海伦与北安、德惠与梨树之间的微生物群落代谢功能相似性较高.综上,不同纬度黑土微生物呼吸特征及群落功能多样性存在差异,高纬度黑土对低温变化敏感,而低纬度黑土对高温变化敏感.     

绵羊羊膜上皮细胞治疗兔桡骨缺损模型的研究

为了确定绵羊羊膜上皮细胞在体内向骨组织的分化能力,实验在分离培养绵羊羊膜上皮细胞并对其进行干细胞特性的鉴定的基础上,制作新西兰大白兔桡骨13mm骨缺损模型,随机分组对其进行注射绵羊羊膜上皮细胞实验。高剂量组:移植细胞5×107个;低剂量组:移植细胞5×106个;对照组:生理盐水。细胞移植后2、4、8周拍摄X光片观察骨缺损部位的缺损修复情况;相应时段取骨缺损部位新生骨进行组织学观察:分析骨小梁生成数量和骨的改建时期。实验结果显示,高剂量实验组在移入细胞第8周,骨缺损完全修复,且同期高剂量组新骨生成的数量和质量明显高于低剂量组,低剂量组优于对照组。由此可见,绵羊羊膜上皮细胞不仅可以在不同种动物间进行移植,而且对骨缺损有良好的修复能力。     

shRNA随机文库结合TK自杀基因筛选靶向HIV-1LTR相关宿主因子

构建shRNA随机文库与HIV-1 LTR启动胸苷激酶基因(TK基因)稳定表达的稳定细胞系HEK293/TK,将两者结合起来,筛选靶向HIV-1 LTR相关宿主因子.方法:通过化学合成含有19个随机脱氧核苷酸的发夹结构,将其退火补平后与合成的接头Linker连接进行PCR反应,将PCR产物酶切后置于慢病毒载体pLenti-U6启动子下游由此构建shRNA随机文库;利用重叠PCR将HIV-1 LTR片段和TK基因连接起来,连接产物经酶切后与pcDNA3.1载体连接;将连接正确的质粒转染HEK293细胞同时用G418加压筛选获得稳定细胞系HEK293/TK;将所获得的文库质粒包装成慢病毒后侵染所构建的HEK293/TK细胞系,通过加入药物GCV进行加压筛选获得存活细胞.结果:成功筛选到加药后存活下来的细胞,抽提细胞基因组,采用巢式PCR扩增目的干扰序列并用Western blot对干扰序列进行验证,鉴定获得一个克隆所表达的shRNA能对TK基因的表达起到抑制作用,通过测序分析获得其干扰序列,该序列很有可能针对HIV-1 LTR某宿主相关因子.结论:成功构建了一种筛选HIV-1 LTR相关宿主因子的方法,筛选所得序列可以定位到具体相关宿主因子,为靶向筛选抗HIV-1药物提供了重要手段.     

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体

目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白( alpha-crystallin Acr)的人源抗体.方法:以结核分枝杆菌Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核分枝杆菌Acr蛋白的抗体,并对可变区序列进行了测序分析.将特异性的噬菌体抗体感染HB2151菌,经IPTG诱导表达,制备了抗结核分枝杆菌Acr蛋白的可溶性单链抗体;对其序列和抗原结合活性进行分析鉴定.结果:经过4轮筛选,获得了43个与结核分枝杆菌Acr蛋白结合的阳性克隆,其中29个特异结合的克隆;测序分析有26不同的可变区片段;通过可溶性单链抗体(scFv)表达筛选到14株特异性结合Acr蛋白的可溶性单链抗体克隆;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群.成功制备了可溶性单链抗体.Westren blotting分析证实筛选的人源单链抗体能与天然蛋白结合.结论:利用单链大容量抗体库获得抗结核分枝杆菌Acr蛋白的噬菌体抗体并且成功制备抗结核分枝杆菌Acr天然蛋白的可溶性单链抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

黄土高原樟子松和落叶松与其他树种枯落叶混合分解对土壤的影响

通过采集树木枯落叶与土壤进行室内混合分解培养试验,研究了黄土高原常见的樟子松和落叶松与其他树种枯落叶混合分解对土壤性质的影响及存在的相互作用,从而为不同树木种间关系的探索和该地区人工纯林的混交改造提供科学指导。结果表明:12种枯落叶单一分解均明显提高了土壤脲酶(54%—110%)、脱氢酶(85%—288%)和磷酸酶(81%—301%)活性以及有机质(29%—55%)和碱解N(12%—49%)含量,但对土壤速效P含量和CEC的影响存在较大差异。综合而言,樟子松分别与白桦、刺槐、白榆、柠条和落叶松枯落叶混合分解在对土壤性质的影响中存在相互促进作用,而分别与小叶杨、沙棘、紫穗槐、侧柏和辽东栎枯落叶混合分解在对土壤性质的影响中存在相互抑制作用;落叶松分别与刺槐、白桦、小叶杨和紫穗槐枯落叶混合分解在对土壤性质的影响中存在相互促进作用,而分别与柠条、侧柏、辽东栎、沙棘、油松和白榆枯落叶混合分解在对土壤性质的影响中存在相互抑制作用。     

心源性猝死患者心肌CX43和C-JUN表达及意义

目的:探讨心源性猝死者心肌细胞中连接蛋白(connexin CX)CX43和原癌基因蛋白(C-JUN)的表达及意义.方法:从2008-2011年青岛市市立医院病理科现有的蜡块中选取心性猝死者40例.其中冠心病22例,肺动脉栓塞10例,病毒性心肌炎5例,扩张性心肌病3例,选取因交通事故、外伤等死亡的病例10例作为对照组.应用免疫组织化学的方法分别检测各组病例中心室肌细胞中C-JUN和CX43蛋白的表达.结果:心源性猝死(SCD)组中心肌细胞中C-JUN的表达明显高于对照组(P＜0.01).而心性猝死组中CX43的表达却低于对照组.SCD组中心肌细胞中C-JUN与CX43的表达正相关(r=0.315,P=0.022).结论:SCD患者心肌细胞中CX43表达和分布异常,结构的重塑导致了致死性心律失常的反生,SCD患者心肌中C-JUN高表达,且与CX43蛋白的表达呈正相关,提示二者可能共同参与了SCD的发生发展,不仅可以用于临床相应药物的研发,还可能称为法医学上对SCD的鉴别提供辅助指标.     

药物引起肾功能损伤的研究进展

肾脏是人体血流量丰富,耗氧量最大的主要脏器之一。药物主要是帮助机体对抗疾病,同时药物也可以引起组织器官的损伤。由于大部分药物及其代谢产物经由肾脏排出体外,大大增加了药物对肾功能损伤的机率。因此,研究药物对肾脏的毒性作用并弄清药物所导致的肾损伤的作用机制,就显得尤为重要。这对于开发新药和临床合理用药均有着重要的意义。本文就目前引起肾损伤药物和引起损伤的相关机制进行综述。     

海南黄牛HSF1 cDNA全长的克隆与序列分析

目的：根据人、小鼠HSF1cDNA保守区序列设计引物,通过PCR方法扩增海南黄牛HSF1cDNA,并进行序列分析。方法：利用RT-PCR、半巢式PCR以及3＇-RACE技术分段扩增得到了海南黄牛HSF1cDNA序列,测序正确后进行拼接。用DNAMAN 生物信息学软件分析海南黄牛HSF1 cDNA与赫里福德牛、人、小鼠同源性和海南黄牛HSF1蛋白的氨基酸组成、等电点、亲/疏水区等蛋白质性质,并根据各种动物HSF1蛋白绘制进化树。结果：（1）海南黄牛的HSF1 cDNA序列全长为1 993bp,包括150bp的5＇非翻译区,1 578bp的开放阅读框以及264bp（不含poly（A）尾）的3＇非翻译区,编码524个氨基酸,分子量为56.42 kD,等电点（pI）为 4.79。（2）海南黄牛的HSF1 cDNA与赫里福德牛、小鼠和人HSF1 cDNA的同源性分别为98.99 %、81.78 %、87.82 %,相应编码蛋白氨基酸序列的同源性分别为98.86 %、83.84 %、89.06 %,其中N-末端和C-末端高度保守,而中间区域存在缺失或替换。（3）根据氨基酸序列构建不同动物HSF1蛋白的进化树,与采用经典遗传分类法构建的进化树基本一致。结论：首次克隆了海南黄牛 HSF1 cDNA全长,分析表明：海南黄牛HSF1蛋白是亲水性蛋白,在8种动物中,其同源性大于73 %,高度保守。海南黄牛与赫里福德牛HSF1蛋白同源性高达98.86 %,在三聚体化区域、转录调节域和激活域存在6个位点的单氨基酸突变,这些发现为进一步揭示海南黄牛抗热性状形成的分子机制提供了重要依据。     

对一株铜绿假单胞菌22种耐药基因的研究

目的研究铜绿假单胞菌多重耐药情况和相关机制。方法采用聚合酶链反应（PCR）法对一株多重耐药铜绿假单胞菌进行β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶（AMEs）基因、喹诺酮类耐药基因、耐消毒剂基因（qacE△1-sul1）和整合酶基因检测,并对VIM基因进行了测序。结果PCR扩增结果显示该菌株aac（6′）-Ⅰb、blaCARB、gyrA、oprD2、ant（2″）-Ⅰ、qacE△1-sul1、blaIMP-I、blaTEM、blaVEB、aac（3）-Ⅱ、ant（3″）-Ⅰ、intⅠ1、blaVIM基因均为阳性,而aac（3）-Ⅰ、aac（6′）-Ⅱ、blaGES、blaGIM、blaOXA-10群、blaPER、blaSPM、blaSHV、blaDHA基因均为阴性,VIM基因扩增产物测序后经BLAST同源性分析表明为VIM-2型。结论铜绿假单胞菌存在多重耐药基因。管壁涂有季胺类、双胍类消毒剂和磺胺的II代导管的抑菌效果需重新评价。