构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒

旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功。将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况。测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功。其在293T细胞中的转染效率约为50%,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果。初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5。     

黄皮种子中酰胺类生物碱及其杀线虫活性研究

为了解黄皮种子中的酰胺类生物碱及其杀线虫活性,运用多种色谱学及波谱学方法分离并鉴定了10个酰胺类生物碱,分别为:N-甲基桂皮酰胺(1),clausenalansamide A(2),3-dehydroxy-3-methoxyl-clausenalansamide A(3),clausenalansamide B(4),黄皮新肉桂酰胺B(5),N-(2-苯乙基)肉桂酰胺(6),2′-dehydroxy-2′-oxo-clausenalansamide B(7),lansamide-7(8),homoclausenamide(9),1,5-dihydro-5-hydroxy-1-methyl-3,5-diphenyl-2H-pyrrol-2-one(10)。其中,化合物3,7,10为新天然产物。首次对黄皮种子中的酰胺类生物碱2~8进行全齿复活线虫致死活性的测试,发现所测化合物均有致死活性,其中,化合物2,3,5和8有较强的致死活性,且均优于阳性对照除线磷,可为相关农药的研发提供科学依据。     

Annexin Ⅱ基因克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人AnnexinⅡ全长cDNA序列,并构建其真核表达载体。方法根据Genbank中AnnexinⅡ基因的碱基序列,利用RT-PCR的方法从人肾脏组织中扩增编码AnnexinⅡ基因,将目的片段与pBS-T载体连接,利用亚克隆的方法将AnnexinⅡ的cDNA片段克隆到pcDNA3.1载体中,并进行序列测定。结果DNA测序证实该片段序列与Genbank完全一致。结论成功克隆人Annexin II全长cDNA序列,并构建出pcDNA3.1—Annexin II真核表达载体,为进一步研究其在肾脏疾病中的作用和机制奠定基础。     

呼吸道合胞病毒G蛋白基因片段的克隆及高效表达

呼吸道合胞病毒(RSV)感染遍布全球,并可导致严重的疾病,但目前尚无成功的疫苗问世.为寻求可能用于RSV疫苗研制的重组蛋白抗原,我们在克隆RSV-A全长G蛋白基因的基础上,构建了多种共表达载体蛋白和G蛋白片段的表达载体,并从中筛选出能以可溶形式高效表达抗原蛋白的原核表达体系.通过亲和层析纯化了重组蛋白抗原DsbA-G101,将其免疫Balb/c小鼠后获得了相应的抗血清.经ELISA检测表明DsbA-G101具有良好的免疫原性.基于本研究所构建的系列表达载体,可以比较不同的G蛋白片段免疫原性的强弱及载体蛋白的优劣,从中发现最佳的RSV抗原蛋白.     

肝再生的调控及原癌基因表达

肝脏再生过程中受到多种体液因素的调控。肝细胞生长因子（ＨＧＦ）、肝刺激因子（ＨＳＳ）等对肝细胞有促分裂作用;转化生长因子β１（ＴＧＦβ１）等则具有抑制作用。此外,肝再生还需要去甲肾上腺素（ＮＥ）、胰岛素等辅助分裂原的存在,共同调节肝再生。肝细胞分裂增殖与原癌基因表达密切相关。肝细胞从静息期进入细胞周期,以及在整个细胞周期中,某些原癌基因有特征性的表达。     

Correlation Between Appearance of Embryogenic Cells and the IAA Levels in Rice Somatic Cell Culture

Changes of endogenous IAA level and IAA action in cultured rice ( Oryza sativa L. ) somatic cells during the period from 7th to 15th day which was the transition from somatic to embryogenic cells were observed. The study was carded out in three experimental systems viz. mature caryopsis and young panicles (2 ~ 5 mm long) of rice cv. "Guangluai 4" under normal osmosis (3% sucrose), mature caryopses from rice cv. "Yanjing 2" or "Guangluai 4" under normal and higher osmosis (5% sucrose or 2.5 % sorbitol). During this period, endogenous IAA contents were greatly increased in young-panicle calli under normal osmosis and mature-caryoptic calli under higher osmosis but decreased in mature-caryoptic calli under normal osmosis. Exogenous IAA could induce the appearance of embryogenic cell from nonembryogenic callus at a lower frequency. And 2,3,5-tri-iodobenzoic acid could increase the frequency of embryogenic cell induction. From these results it could be concluded that accumulation of higher IAA level in the cultured rice cells was essential for induction of embryogenic cell appearance. Since 2,4-D was involved in all induction medium with the same concentration but exerted different effects on embryogenic cell induction, it was suggested that it might act through mediating the endogenous IAA metabolism.     

基于DSSAT模型对豫北地区夏玉米灌溉制度的优化模拟

合理的灌溉制度是提高农业水资源利用效率、保证夏玉米高产稳产的前提。采用农业技术转化决策系统(DSSAT,Decision Support System for Agrotechno1ogy Transfer)探究了河南省北部地区夏玉米不同降水年型下的最优灌溉制度。经过参数的校正和验证,归一化均方根误差(nRMSE)、均方根误差(RMSE)和一致性指数(d)均表现出模拟值与实测值的吻合度很好,DSSAT-maize模型可以准确模拟夏玉米物候期、地上部分生物量、产量和土壤水分状况。然后基于模型模拟了不同灌溉处理下的夏玉米生产潜力,从而评估夏玉米缺水量,并对比分析不同生育时期灌水对产量的影响确定最优灌溉时期,综合考虑产量和水分利用效率确定最优灌溉制度。结果表明:夏玉米生长季的缺水量年际间差异显著,多年平均值为38.91 mm,波动范围为0—193.03 mm。在丰水年,不需要灌溉;在平水年,开花期灌水30 mm;在枯水年,开花期和灌浆期灌水50 mm;在特别干旱年,苗期、拔节期和开花期至少灌水180 mm。优化的灌溉制度下丰水年、平水年和枯水年的WUE达到最高且产量分别占其最高产量的100%、99.72%和97.89%,实现了作物高产节水协同提高的目标。     

猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型RTX毒素I的N-端表达多肽具有良好的免疫原性

ApxI外毒素是猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)最重要的毒力因子,为了研究其N端多肽的免疫原性,分别将apxIA基因的全长编码区(apxIA,3146bp)及其5′端1140bp的片段(apxIA5)克隆到原核表达载体pET28a,经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了表达,表达产物ApxIA和ApxIAN均以包涵体的形式存在,Westernblot检测证实两种表达产物均具有免疫反应性。将纯化的重组蛋白(rApxIA和rApxIAN)和提取的天然毒素ApxI(nApxI)分别经腹腔免疫BALBc小鼠,于免疫前、免疫2周和4周后分别检测了ELISA抗体和毒素中和抗体水平,结果表明,rApxIAN免疫组的ELISA抗体显著低于rApxIA免疫组和nApxI免疫组,但rApxIAN免疫组血清中和试验中测定的溶血素单位与rApxIA及天然nApxI免疫组没有显著差异。第二次免疫2周后,用1个LD50的APP血清1型J101株和2型标准菌株攻击试验动物,rApxIAN免疫组对血清1型和2型菌株的保护率分别为80%和100%。     

红豆杉细胞悬浮培养结构化数学模型的探讨

用１０Ｌ机械搅拌式生物反应器悬浮培养红豆杉细胞,得到细胞生长、基质消耗和紫杉醇合成动力学曲线。经过代谢动力学分析建立了结构化数学模型。并将模型值与实验值进行比较,结果表明模型预测值与实验值较吻合。     

Snail基因修饰对骨髓基质干细胞骨架结构稳定作用及促迁移和对无血清培养诱导细胞凋亡的保护作用研究

转录因子Snail是调控肿瘤细胞迁徙转移的重要调控分子,基于干细胞与肿瘤细胞分子机制的重叠性,提出通过借鉴肿瘤细胞迁移的相关机制以用于提高骨髓基质干细胞向缺氧受损组织迁移能力的假设和研究思路,探讨Snail基因在人骨髓基质干细胞(MSCs)中的转染和表达情况,及转染后对基质干细胞促迁移作用、骨架结构的稳定作用及对无血清培养诱导细胞凋亡的保护作用。密度梯度离心法及细胞体外培养分离纯化人骨髓MSCs,脂质体法将重组表达载体pCAGGSneo-Snail-HA转染MSCs,G418筛选稳定表达,流式细胞仪检测MSCs表面抗原,采用免疫荧光染色技术检测转染后MSCs报告基因HA及目的基因Snail表达,Transwell细胞迁移实验和Western-blot评估细胞迁移能力和检测有关细胞信号转导通路分子水平变化,荧光染色分析细胞骨架,Sub-G1凋亡峰流式细胞仪检测细胞凋亡率并评估细胞抗凋亡能力。经流式细胞仪选择检测分离纯化扩增MSCs表面分子特点为CD34(-)/CD29( ),Snail及报告基因在转染后MSCs呈阳性表达,Snail质粒转染MSCs(MSCs-Sna)较对照空质粒转染MSCs(MSCs-neo)细胞迁移率增加(P<0.05),PI-3K信号通路特异性抑制剂Wortmannin能显著抑制此迁移率的增加,无血清培养72h后,MSCs-Sna凋亡率较MSCs-neo低(P<0.05)。经Snail基因转染,MSCs迁移能力、骨架结构的稳定性及在无血清培养环境中抗凋亡能力增加。