慢病毒载体介导IκB激酶-α(IKKα)基因RNA干扰转基因小鼠的制备

IκB激酶-α(IKKα)的功能与淋巴形成和乳腺发育相关,在乳腺肿瘤中观察到IKKα蛋白的过量表达.应用小鼠受精卵卵周隙注射慢病毒载体的方式,建立IKKα基因RNAi转基因小鼠模型,为在体内研究IKKα基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件.实验构建了针对IKKα基因RNAi(剔降)的慢病毒载体,并将载体导入小鼠受精卵卵周隙,获得携带该载体的转基因小鼠模型,经PCR鉴定首建鼠阳性率为15%.转基因小鼠外周血细胞IKKαmRNA表达量明显降低.初步表型观察分析,IKKα基因RNAi小鼠发育正常,进一步的分析工作正在进行中.     

中国东南高海拔黄山松生长对气候的响应——以浙江省九龙山和安徽省牯牛降为例

利用中国浙江省西南部九龙山自然保护区和安徽省南部牯牛降的高海拔黄山松树轮径向宽度资料,分别建立了2个树轮宽度差值年表(RES).由子样本信号强度(SSS)>0.8判定,九龙山年表(JLS01)的可靠时段为1884—2010年,牯牛降年表(GNJ01)的可靠时段为1837—2008年.将采样点周围气象站气象数据做算术平均代表区域气候状况,利用相关函数检验了两年表与区域气象数据的月降水量、月平均温度、月平均相对湿度、月总云量和月日照时数的关系.结果表明： 2个高海拔点树木径向生长主要受夏季(上年6、7月,当年6月)水热条件的影响.九龙山年表与上年6、7月温度呈显著正相关,与上年6、7月和当年6月降水及相对湿度呈显著负相关,与上年7月总云量呈显著负相关,与上年6、7月日照时数呈显著正相关;牯牛降年表与上年7月温度呈显著正相关,与上年7月和当年6月降水及相对湿度呈显著负相关,与上年6月总云量呈显著负相关,与上年7月、当年6月日照时数呈显著正相关.由于高海拔地区温度较低,夏季温度的升高有利于该地区树木生长,同时较多降水对应的高相对湿度、高云量和低日照时数,限制了光合作用产物的合成,导致树木的径向生长受到抑制.
     

抗肿瘤药物帕玛度胺类似物的合成

目的：设计并合成抗肿瘤药物帕玛度胺的3位N取代的新型类似物。方法：从3-硝基邻苯二甲酸（2）和N-（叔丁氧羰基）．L-谷氨酰胺（4）出发,经过六步反应得到目标化合物。3-硝基邻苯二甲酸（2）经脱水制得3-硝基邻苯二甲酸酐（3）。用N-（叔丁氧羰基）-L-谷氨酰胺（4）经闭环、脱保护制得3-氨基-2,6-哌啶二酮三氟乙酸盐（6）。4与6经缩合、钯碳催化氢化制得免疫调节剂Pomalidomide（8）,（8）经过酰化得到3-乙酰氨基-N-（2,6-二氧代-3-哌啶基）邻苯二甲酰亚胺（1）。以（4）计总收率约34．9％。结果：得到3-乙酰氨基-N-（2,6-二氧代-3-哌啶基）-邻苯二甲酰亚胺（1）,应用于细胞活性测试。结论：改进了帕玛度胺的合成工艺,得到了3位N乙酰化的新型帕玛度胺类似物（1）,初步研究显示（1）的生物活性与帕玛度胺接近。     

大气CO2浓度升高对稻季土壤中麦秸降解及氮素分趋的影响

利用中国唯一的稻麦轮作FACE(free-air carbon dioxide enrichment,开放式空气CO2浓度增高)试验平台,研究大气CO2浓度升高对稻季土壤中小麦秸秆降解速率及其氮素分趋的影响.试验设置Ambient(目前空气对照)和FACE(Ambient+200 μmol·mol-1)两个CO2浓度以及低氮处理(LN,150 kg·hm-2)和高氮处理(HN,250 kg·hm-2)两个氮肥水平,在稻季之初按标记麦秸/土壤重量比0.3%添加15N标记小麦秸秆,根据水稻生长时期依次采样测定秸秆降解速率,并通过分析土壤全氮、植株全氮及其15N丰度来观察已降解秸秆的氮素分趋情况.结果发现,大气CO2浓度升高对高氮处理土壤中小麦秸秆降解速率没有显著影响,但显著促进了低氮处理土壤中小麦秸秆的降解(p < 0.05),使其提高到与高氮处理土壤相当水平;大气CO2浓度升高显著增加了已降解秸秆中氮素的流失,在高氮处理土壤中尤为严重,而对植物吸收已降解秸秆中的氮素没有显著影响.结果表明,大气CO2浓度升高在土壤氮素相对不足时会加速土壤中小麦秸秆的降解,而在土壤氮素相对充足时又会加大降解秸秆中氮素的流失.     

高效微生物絮凝剂D6对屠宰废水的应用研究

筛选出一株针对屠宰废水有高效絮凝活性的微生物絮凝剂产生菌,并对其所产微生物絮凝剂D6进行单因子絮凝条件优化和正交试验优化得到最佳絮凝条件。絮凝条件包括:微生物絮凝剂D6投加量、pH、金属离子种类、1%CaCl₂投加量。试验中发现碱性环境是微生物絮凝剂D6发挥絮凝活性的前提,表明微生物絮凝剂D6分子链的充分伸展对絮凝作用起决定因素,因此微生物絮凝剂D6的絮凝机理为吸附架桥作用。其最佳絮凝条件为微生物絮凝剂D6的投加量为25mL·L^-1,1%CaCl₂投加量55mL·L^-1,pH为8。在最佳絮凝条件下,絮凝率为96.6%,浊度去除率为97.8%,SS去除率为92.6%。     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6的表达、纯化和鉴定

目的:克隆结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出ESAT-6基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白经SDS-PAGE及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果:成功克隆了ESAT-6基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western-blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得34kD纯化蛋白,与文献报道相符。结论:成功获得了纯化的ESAT-6蛋白,为进一步研究ESAT-6蛋白的致病机理提供了实验依据。     

冬虫夏草菌丝状菌源增殖培养的研究

冬虫夏草菌是珍稀濒危名贵中药材冬虫夏草的无性型菌种,是侵染蝠蛾幼虫的唯一菌种,其侵染后形成名贵中药材冬虫夏草。冬虫夏草菌在不同营养及条件下生长形态不同,主要有丝状体和菌球体两种生长形态。冬虫夏草菌丝状菌体能够侵染蝠蛾幼虫,有可能作为一种新的接种体被广泛应用;但丝状菌体对营养要求苛刻、生长缓慢、菌丝体得率低的特点,阻碍了冬虫夏草菌丝状菌体作为侵染蝠蛾幼虫的接种体的开发及应用,从而阻碍了冬虫夏草人工培殖产业化的进程。为了提高冬虫夏草菌丝状菌体的生物表达量,本文对营养及培养条件进行了优化研究,得出了最佳条件为:葡萄糖质量浓度40 g/L、酵母粉质量浓度65 g/L、培养温度17℃、MgSO_4质量浓度3 g/L、KH_2PO_4质量浓度1.5 g/L、培养时间12 d,按最优培养条件,冬虫夏草菌丝状菌体干重得率15.67 g/L,为下一步新的接种体的制备提供菌源保障。     

Genome shuffling筛选ε-聚赖氨酸高产菌及其对代谢流量分配的影响

【目的】从代谢流量分配的角度,探讨Genome shuffling导致链霉菌ε-聚赖氨酸合成量提升的原因。【方法】从葡萄糖耐受型的亲本菌株Streptomyces sp.AS32和ε-聚赖氨酸耐受型的亲本菌株Streptomyces albulus F15出发,进行三轮Genome shuffling,筛选得到ε-聚赖氨酸产量提高的链霉菌株Streptomyces sp.AF3-44,采用通量分析方法构建链霉菌ε-聚赖氨酸合成代谢网络,并对上述3株菌的代谢通量进行比较。【结果】AF3-44的ε-聚赖氨酸摇瓶产量为3.1 g/L,较AS32和F15分别提高了34%和29%。3株菌株中AS32三羧酸循环(TCA)的代谢通量最高;F15磷酸戊糖途径(PPP)代谢通量最高;AF3-44流向赖氨酸合成前体天冬氨酸以及ε-聚赖氨酸的通量最高,TCA和PPP通量位于两亲本菌株的中间水平,其中TCA中流向异柠檬酸的通量分别为AS32和F15的77%和116%,PPP中流向5-磷酸核酮糖的通量分别为AS32和F15的149%和92%。【结论】Genome shuffling导致了代谢流的重新分布,流向前体赖氨酸和ε-聚赖氨酸通量的增加,以及PPP和TCA通量配比的改变是链霉菌ε-聚赖氨酸合成量增加的重要因素。     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6的表达、纯化和鉴定

目的：克隆结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法：用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出ESAT-6基因片段,克隆至pMD18一T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T－1并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白经SDS—PAGE及Westem—blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果：成功克隆了ESAT-6基因,并对其在E．coli中进行了表达,SDS—PAGE及Western—blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得34kD纯化蛋白,与文献报道相符。结论：成功获得了纯化的ESAT-6蛋白,为进一步研究ESAT－6蛋白的致病机理提供了实验依据。     

早期人胚胎cDNA文库构建及目的基因筛选

收集受精后３、４和５周龄药物流产胚胎,用改良一步法提取总ＲＮＡ,ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维素柱纯化ｍＲＮＡ,逆转录合成一链ｃＤＮＡ,完成二链ｃＤＮＡ的合成后,经碱变性电泳检测,合成ｃＤＮＡ的大小为０．４～９．０ｋｂ之间,且主要集中在１．０～２．０ｋｂ。除去多余的接头,收集大于４００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,与载体ｐＳＰＯＲＴ１和和γＺｉｐＬｏｘ连接,分别得到３、４、５周龄人胚胎质粒文加和噬菌体文库。另外,采