结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6的表达、纯化和鉴定

目的:克隆结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出ESAT-6基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白经SDS-PAGE及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果:成功克隆了ESAT-6基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western-blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得34kD纯化蛋白,与文献报道相符。结论:成功获得了纯化的ESAT-6蛋白,为进一步研究ESAT-6蛋白的致病机理提供了实验依据。     

冬虫夏草菌丝状菌源增殖培养的研究

冬虫夏草菌是珍稀濒危名贵中药材冬虫夏草的无性型菌种,是侵染蝠蛾幼虫的唯一菌种,其侵染后形成名贵中药材冬虫夏草。冬虫夏草菌在不同营养及条件下生长形态不同,主要有丝状体和菌球体两种生长形态。冬虫夏草菌丝状菌体能够侵染蝠蛾幼虫,有可能作为一种新的接种体被广泛应用;但丝状菌体对营养要求苛刻、生长缓慢、菌丝体得率低的特点,阻碍了冬虫夏草菌丝状菌体作为侵染蝠蛾幼虫的接种体的开发及应用,从而阻碍了冬虫夏草人工培殖产业化的进程。为了提高冬虫夏草菌丝状菌体的生物表达量,本文对营养及培养条件进行了优化研究,得出了最佳条件为:葡萄糖质量浓度40 g/L、酵母粉质量浓度65 g/L、培养温度17℃、MgSO_4质量浓度3 g/L、KH_2PO_4质量浓度1.5 g/L、培养时间12 d,按最优培养条件,冬虫夏草菌丝状菌体干重得率15.67 g/L,为下一步新的接种体的制备提供菌源保障。     

Genome shuffling筛选ε-聚赖氨酸高产菌及其对代谢流量分配的影响

【目的】从代谢流量分配的角度,探讨Genome shuffling导致链霉菌ε-聚赖氨酸合成量提升的原因。【方法】从葡萄糖耐受型的亲本菌株Streptomyces sp.AS32和ε-聚赖氨酸耐受型的亲本菌株Streptomyces albulus F15出发,进行三轮Genome shuffling,筛选得到ε-聚赖氨酸产量提高的链霉菌株Streptomyces sp.AF3-44,采用通量分析方法构建链霉菌ε-聚赖氨酸合成代谢网络,并对上述3株菌的代谢通量进行比较。【结果】AF3-44的ε-聚赖氨酸摇瓶产量为3.1 g/L,较AS32和F15分别提高了34%和29%。3株菌株中AS32三羧酸循环(TCA)的代谢通量最高;F15磷酸戊糖途径(PPP)代谢通量最高;AF3-44流向赖氨酸合成前体天冬氨酸以及ε-聚赖氨酸的通量最高,TCA和PPP通量位于两亲本菌株的中间水平,其中TCA中流向异柠檬酸的通量分别为AS32和F15的77%和116%,PPP中流向5-磷酸核酮糖的通量分别为AS32和F15的149%和92%。【结论】Genome shuffling导致了代谢流的重新分布,流向前体赖氨酸和ε-聚赖氨酸通量的增加,以及PPP和TCA通量配比的改变是链霉菌ε-聚赖氨酸合成量增加的重要因素。     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6的表达、纯化和鉴定

目的：克隆结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法：用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出ESAT-6基因片段,克隆至pMD18一T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T－1并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白经SDS—PAGE及Westem—blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果：成功克隆了ESAT-6基因,并对其在E．coli中进行了表达,SDS—PAGE及Western—blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得34kD纯化蛋白,与文献报道相符。结论：成功获得了纯化的ESAT-6蛋白,为进一步研究ESAT－6蛋白的致病机理提供了实验依据。     

早期人胚胎cDNA文库构建及目的基因筛选

收集受精后３、４和５周龄药物流产胚胎,用改良一步法提取总ＲＮＡ,ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维素柱纯化ｍＲＮＡ,逆转录合成一链ｃＤＮＡ,完成二链ｃＤＮＡ的合成后,经碱变性电泳检测,合成ｃＤＮＡ的大小为０．４～９．０ｋｂ之间,且主要集中在１．０～２．０ｋｂ。除去多余的接头,收集大于４００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,与载体ｐＳＰＯＲＴ１和和γＺｉｐＬｏｘ连接,分别得到３、４、５周龄人胚胎质粒文加和噬菌体文库。另外,采     

人干细胞生长因子Ca2+依赖糖识别结构域缺失突变体的重组表达及生物学活性的初步探讨

本作已有的研究结果证明,完整的人干细胞生长因子(hSCGF)没有种属特异性,即可以作用于小鼠骨髓造血细胞。这一点与在Ca^2 依赖糖识别结构域(CRD)缺失了78个氨基酸残基的截短分子(hSCGFβ)有所不同。本研究从hSCGF全长cDNA中完全删除了CRD结构域编码序列,进一步探讨CRD结构域的生物学功能。由于该突变体序列GC含量较高．因此将该缺失突变体序列克隆在GST融合表达载体中进行融合表达。通过低温(28℃)诱导,表达产物主要以可溶蛋白的形式存在。利用亲和层析纯化CRD结构域完全缺失的hSCGF突变体融合蛋白,通过检测重组突变分子的协同刺激造血活性有无改变来初步探讨CRD结构域在hSCGF分子中的生物学功能。研究结果表明,去掉完整CRD结构域的突变分子仍然具有造血刺激活性。据此推断CRD结构域在hSCGF分子中可能对于受体配体结合起辅助作用。     

狗牙根颖果胚性愈伤组织的诱导和胚性细胞的超微结构及植株再生

以普通狗牙根[Cynodon dacylon(L.)Pers.cv.'Suncitv']颖果为外植体,以MS为基本培养基,外加浓度在2.0～6.0mg/L的2,4-D,能高频率地诱导出高质量的胚性愈伤组织,其中以4.0 mg/L为最佳.胚性愈伤组织最佳继代及分化的培养方法为:用MS 2,4-D 4.0mg/L继代1～2次,然后转入1/2 MS 2,4-D 2.0 mg/L中继代1～2次,再在无激素的1/2MS中光照培养10 d,最后在MS 6-BA 3.0 mg/L中诱导分化,分化成苗率达31.7%.经电镜观察发现,胚性愈伤组织结构紧密,细胞较小,内容物丰富,而非胚性愈伤组织结构疏松,细胞巨大,内含一大液泡,几无细胞器.     

超临界CO2萃取红景天中红景天苷、苷元酪醇的研究

采用超临界CO₂ 萃取法和乙醇常温浸提法相比较, 研究从红景天中提取红景天苷、苷元酪醇的工艺条件, 结论是:采用超临界CO₂ 萃取法能萃取出红景天生药中红景天苷的1.2%, 提取率不高, 但该方法能萃取出80%的苷元酪醇, 萃取液中苷元酪醇的相对含量可达45.68%;乙醇常温浸提法能将红景天苷、苷元酪醇同时有效萃取, 且得率较高, 但是萃取液中两物质相对含量较低, 进一步分离纯化将有难度。本研究结果表明, 将超临界CO₂ 萃取法和乙醇常温浸提法有效结合, 可实现两物质的有效分离, 推进红景天有效成分的产业化进程。     

呼吸监护室下呼吸道铜绿假单胞菌β-内酰胺类抗生素耐药相关基因研究

目的了解呼吸监护室下呼吸道分离的铜绿假单胞菌中β-内酰胺类抗生素耐药相关基因存在状况。方法自呼吸监护室下呼吸道感染患者的痰标本中分离37株铜绿假单胞菌,采用聚合酶链反应(PCR)检测耐药基因(TEM、SHV、OXA-1群、OXA-10群、PER、VEB、GES、CARB、IMP、VIM、SPM、GIM、DHA和oprD2)。结果37株铜绿假单胞菌中CARB阳性15株(40.5%),oprD2基因缺失33株(89.2%),其余基因均阴性。结论呼吸监护室下呼吸道分离的铜绿假单胞菌CARB基因携带率高,oprD2基因缺失严重。