基于CRISPR-Cas9技术构建橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统

[背景]CRISPR-Cas9基因组编辑技术为病原真菌的基因敲除、敲入及定点编辑提供了新的思路。[目的]建立适用于橡胶树胶孢炭疽菌的CRISPR-Cas9基因敲除系统。[方法]通过大肠杆菌原核表达系统合成含有细胞核定位信号的Cas9蛋白;以URA5为靶标基因,预测该基因中Cas9的切割位点,并在体外转录合成相应的SgRNA;体外构建Cas9-SgRNA复合体,并将该复合体转入橡胶树胶孢炭疽菌原生质体;通过表型筛选及测序鉴定,筛选URA5的敲除突变体菌株。[结果]体外表达的Cas9蛋白与SgRNA能够形成复合体,并在体外对目标基因URA5的DNA序列进行切割;Cas9-SgRNA复合体能够成功转入橡胶树胶孢炭疽菌原生质体,并完成对URA5的敲除;敲除突变株表现出尿嘧啶缺陷表现型。[结论]建立了适用于橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统。     

卧龙自然保护区大熊猫生境恢复过程研究

保护与恢复生境是有效保护大熊猫的重要途径,通过样方调查法研究了卧龙自然保护区大熊猫（Ａｉｌｕｒｏｐｏｄａ　ｍｅｌａｎｏｌｅｕｃａ）恢复生境的群落结构特征,共调查了原始生境、２０世纪２０一３０年代砍伐后自然恢复生境、４０一５０年代砍伐后自然恢复生境、７０年代以后自然恢复生境以及６０一７０年代人工林等５个生境类型,２１个样方。研究结果表明：各生境类型的物种丰富度、物种多样性、植株数（高度＞５ｍ）、乔木层的平均胸径和最大平均胸径,以及大熊猫的生境成熟度都存在显著差异,竹子的生物量及更新能力也有一定差异。人工林与原始生境的群落相似性低于其他自然恢复生境与原始生境的群落相似性。研究发现,大熊猫生境恢复包括大熊猫可食竹类资源的恢复以及生境群落结构的恢复。可食竹类资源恢复所需时间相对较短,仅需约２０一３０ａ;生境的植物群落结构的恢复则要长的多,一般恢复时间５０ａ左右才能成为大熊猫的适宜生境,恢复时间为７０一８０ａ的生境与原始生境的群落结构已十分接近。通过人工造林恢复生境,无论从竹子资源的恢复,还是从植物群落结构的恢复方面,均不是一种有效地恢复大熊猫生境的方式。     

高亲和力抗乙型肝炎病毒PreS1的人源单链抗体的获得：天然及免疫抗体库的对比研究(英)

以健康人的外周血淋巴细胞为来源,以偶联BSA的乙型肝炎病毒PreS1肽体外免疫.分别从免疫和未经免疫的淋巴细胞提取RNA,扩增抗体基因,构建大容量天然单链抗体（scFv）噬菌体展示文库和体外免疫scFv抗体库.以PreS1肽进行3轮淘选后,抗原抗体反应结果显示,从免疫库中获得了亲和力10^-7～10^-8 M的抗乙型肝炎病毒PreS1的单链抗体,高于天然库的结果（10^-6～10^-7 M）.测序结果表明两株抗体均为人抗体.为基因工程抗体用于临床治疗乙型肝炎奠定基础.同时证明淋巴细胞体外免疫方法构建的免疫抗体库优于大容量天然抗体库.     

双光子及共聚焦激光扫描显微术研究天花粉蛋白对人绒癌细胞的作用机制

天花粉蛋白(trichosanthin, TCS)是从中草药栝楼根中提取的一种核糖体失活蛋白,具有抗肿瘤和抗HIV功能.应用双光子及共聚焦激光扫描显微术结合特异性荧光探针Hoechst 33342、2′,7′-二氯荧光黄双乙酸酯 (DCFH-DA)、Indo-1和Fluo 3-AM,首次同时观察了TCS诱导人绒癌细胞（JAR细胞）凋亡过程中活性氧自由基（ROS）和细胞内钙离子浓度（［Ca²⁺］_i）的变化,实验结果表明TCS引起的［Ca²⁺］_i升高和ROS形成参与了TCS诱导的JAR细胞凋亡,并且ROS形成和［Ca²⁺］_i升高有关.共聚焦激光扫描显微术的研究结果表明,［Ca²⁺］_i升高不是导致ROS形成的主要原因,TCS诱导产生的ROS可能是通过TCS与JAR细胞膜表面受体作用介导的.     

低温胁迫对灰飞虱种群生长发育与繁殖的影响

为了探讨低温在灰飞虱Laodelphax striatellus(Fallén)种群发生发展中的作用,本文以南京冬季的旬平均最低温为依据,设定出-6～2℃的低温,研究了用该低温处理3～4龄若虫不同时间后,灰飞虱的存活、生长与繁殖特性。结果表明,灰飞虱3～4龄若虫有较强的耐低温能力,-6～2℃的温度下,其半致迷和半致死时间分别为1.22和20.49d。低温抑制了若虫的生长发育,发育历期明显延长。低温处理后成虫的性比有所提高,并且短翅率显著增加。3～4龄若虫低温处理1～7d后羽化的成虫有产卵前期缩短、寿命延长的趋势,但对繁殖力没有显著影响,并且低温处理2d后的产卵量要稍高于没有处理的对照。由此可见,-6～2℃低温的短期胁迫对灰飞虱种群的发生发展不会产生抑制作用。     

Gln49-磷脂酶A2基因工程定点突变及酶活性分析

为了确认49位谷氨酰胺磷脂酶A2（Glutamine 49 phospholipase A2, Gln49-PLA2）酶活性缺失与氨基酸序列的相关性,对Gln49-PLA2编码基因第49位氨基酸进行PCR定点突变,利用pET32a+质粒载体在大肠杆菌中表达Gln49-磷脂酶A2的突变体--天冬氨酸磷脂酶A2（Aspartic acid 49 phospholipase A2, Asp49-PLA2--Q49D-PLA2）。将表达的包涵体蛋白变性,采用固定化金属离子亲和层析进行柱上复性、纯化获得突变体融合蛋白（fusion Q49D-PLA2--fQ49D-PLA2）;突变体融合蛋白经蛋白水解酶Factor Xa酶切后,采用Hitrap SP阳离子交换层析和Superdex 75凝胶层析进一步纯化,得到突变体蛋白Q49D-PLA2,得率为1.3%,比酶活为72U/mg。从而证实Gln49-PLA2酶活性缺失的关键原因是49位氨基酸为谷氨酰胺。     

The auxin response factor,OsARF19, controls rice leaf angles through positively regulating OsGH3‐5 and OsBRI1

Auxin and brassinosteroid (BR) are important phytohormones for controlling lamina inclination implicated in plant architecture and grain yield. But the molecular mechanism of auxin and BR crosstalk for regulating lamina inclination remains unknown. Auxin response factors (ARFs) control various aspects of plant growth and development. We here report that OsARF19‐overexpression rice lines show an enlarged lamina inclination due to increase of its adaxial cell division. OsARF19 is expressed in various organs including lamina joint and strongly induced by auxin and BR. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) and yeast one‐hybrid assays demonstrate that OsARF19 binds to the promoter of OsGH3‐5 and brassinosteroid insensitive 1 (OsBRI1) directing their expression. OsGH3‐5‐overexpression lines show a similar phenotype as OsARF19‐O1. Free auxin contents in the lamina joint of OsGH3‐5‐O1 or OsARF19‐O1 are reduced. OsGH3‐5 is localized at the endoplasmic retieulum (ER) matching reduction of the free auxin contents in OsGH3‐5‐O1. osarf19‐TDNA and osgh3‐5‐Tos17 mutants without erected leaves show a function redundancy with other members of their gene family. OsARF19‐overexpression lines are sensitive to exogenous BR treatment and alter the expressions of genes related to BR signalling. These findings provide novel insights into auxin and BR signalling, and might have significant implications for improving plant architecture of monocot crops.     

荒漠草原沙漠化植物群落及土壤物理变化

沙漠化是草地退化最严重的形式之一。以空间代替时间的方法,通过对宁夏中北部荒漠草原沙漠化过程中植物群落特征和土壤物理特性的研究,探讨草地植物群落与土壤物理特性对沙漠化的响应机制。结果表明:(1)潜在沙漠化阶段草地以牛枝子、猪毛蒿、中亚白草为优势种,轻度沙漠化阶段草地以中亚白草、苦豆子为优势种,中度沙漠化阶段草地以狗尾草、虫实为优势种,重度沙漠化阶段草地以沙米、赖草、狗尾草为优势种,极度沙漠化阶段草地以沙米为优势种。(2)随着沙漠化程度的加剧草地植物群落生物量、Shannon-Wiener指数、丰富度指数、盖度均呈降低趋势,但轻度沙漠化阶段草地植被生物量比潜在沙漠化增加了23%。(3)草地沙漠化导致土壤容重和土壤粗砂粒含量增加,而土壤水分,土壤细砂粒和粘粉粒含量降低。荒漠草原沙漠化导致了土壤环境和植被明显退化,草地生产力明显降低。     

中国洞穴甲壳动物多样性及其对洞穴环境的适应性

简要阐述了洞穴环境的研究现状以及洞穴动物的生态特征,初步探讨了中国洞穴甲壳动物的形成过程、多样性、地理分布以及对洞穴环境的适应性。截止到2008年10月,我国已记录的洞穴甲壳动物(主要指十足目虾类和端足目钩虾类)共有33种,分别隶属6科10属,主要分布在贵州省、广西省等喀斯特洞穴密集地区。洞穴甲壳动物由于长期生活在洞穴的黑暗带,食物匮乏,水温恒定,CO2浓度过高,且O2浓度相对较少的环境中,其在形态结构、消化系统、生理及行为等方面逐渐表现出与地表甲壳动物不同的适应性特征。如:眼缺失、体无色、触角和附肢显著增长、新陈代谢减慢、代谢率小,昼夜节律降低,不能调节体温,生活步调放慢,寿命长,发育周期长等。     

胞浆内精子注射技术生产小鼠

以piezo操作系统为技术支撑 ,在掌握小鼠卵母细胞胞浆内精子注射技术 (ICSI)的基础上 ,进行了ICSI技术生产试管小鼠的尝试。来自成年昆明 (KM)小鼠附睾尾的新鲜精子 ,剪切去尾后 ,直接将精子头注射到B6D2F1小鼠卵母细胞质中 ,注射后 1h ,83.3%的卵母细胞存活。6h时 ,84.0 %的成活卵子成功受精 ,形成原核 ,排出PB2 体外培养的ICSI胚胎 ,卵裂率 (98%vs 94.7% )和 4-细胞期胚胎比率 (89.5%vs 92.1% )均与培养的体内受精卵没有差异 (P >0.05 ) ;但是 ,桑椹胚(63.8%vs84.2% )和囊胚发育率 (25.7%vs68.4% )极显著地 (P <0.01)低于对照组。120枚原核期胚胎移植给 7只假孕受体后 ,4只受孕小鼠共产出 28只ICSI小鼠 (23.3% )。健康成年的 25只ICSI小鼠都没有明显的生理和行为异常。随机选择其中的 20只小鼠 ,分别进行ICSI小鼠间、ICSI与KM小鼠间共 12组的交配 ,结果所有雌鼠妊娠产仔。在成功建立小鼠ICSI技术的基础上,成功获得了我国的首例ICSI小鼠,并且证明这些ICSI小鼠都具有正常的繁殖后代的能力。