幼虫密度和温度对水芹叶象甲未成熟阶段生长发育的影响

[目的]为明确不同幼虫密度和不同温度条件对水芹叶象甲Hypera sp.未成熟阶段生长发育的影响.[方法]在室内条件下对不同幼虫饲养密度和不同温度条件饲养的水芹叶象甲未成熟阶段(卵、幼虫、预蛹和蛹)的存活和生长发育进行研究.[结果]幼虫密度对水芹叶象甲幼虫、预蛹和蛹的存活和生长发育均具有显著影响.水芹叶象甲幼虫、预蛹和蛹在50头/盒的密度条件下的存活率均显著高于其它密度条件,且发育历期显著短于其它密度条件.此外,各密度条件下的雌蛹重均显著重于雄蛹重,但性比(♀/♂)不受密度条件的影响.温度条件对水芹叶象甲卵、幼虫、预蛹和蛹的存活和生长发育亦均具有显著影响.27℃条件下的幼虫和蛹的存活率均显著高于其它温度条件,1龄幼虫在30℃条件下的存活率显著高于其它温度条件,而3龄幼虫在27℃条件下的存活率显著高于其它温度条件,但温度条件对2龄幼虫的存活率无显著影响.水芹叶象甲各龄期幼虫及各虫态的发育历期随着温度升高而显著缩短.[结论]幼虫饲养密度和温度是影响水芹叶象甲种群变化的重要因子,这将为分析水芹叶象甲种群动态变化规律,以 及提高该虫的预测预报和综合防控水平提供依据.     

Thr28突变对虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ钠通道活性的影响

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ(HWTX-Ⅳ)是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化到的一种新型多肽类神经毒素,能明显抑制表达于大鼠背根神经节细胞的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道.为了更好地研究该毒素的结构与功能之间的关系,采用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成法合成了用谷氨酸(Glu)替代HWTX-Ⅳ第28位苏氨酸残基的突变体T28D-HWTX-Ⅳ,线性多肽合成产物经反相高效液相色谱(HPLC)分离纯化后进行谷胱甘肽氧化复性.复性产物采用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)技术鉴定分子质量,通过全细胞膜片钳电生理技术测定其电压门控钠通道药理学活性.当第28位Thr残基被Glu取代后,突变体T28D-HWTX-Ⅳ对表达于大鼠DRG细胞膜上的TTX-S钠通道的IC50值约为362 nmol/L,对TTX-S钠通道的抑制活性比天然HWTX-Ⅳ(IC50值=30 nmol/L)下降了约12倍,显示第28位的Thr残基是HWTX-Ⅳ与TTX-S型钠通道相互作用的关键活性残基.目前的研究为进一步探索HWTX-Ⅳ的结构与功能关系及新型镇痛药物的研发奠定了基础.     

斑马鱼Fbxl5基因多克隆抗体的制备与检测

Fbxl5为F-box基因家族的一员,目前研究发现其与心脏的发育有关。为了在斑马鱼模型中进一步研究该基因的功能,有必要制备其多克隆抗体。通过桥式PCR扩增出亲水性和特异性均好的斑马鱼Fbxl5基因片段,将其克隆入表达载体pET-28a,转化至大肠杆菌Rosseta中。用IPTG诱导Fbxl5重组质粒得到His-Fbxl5的融合蛋白。这个融合蛋白用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的His-Fbxl5融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。使用Western Blot检测,获得了Fbxl5原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Fbxl5多克隆抗体。随后检测了Fbxl5在斑马鱼胚胎和成体组织中蛋白的表达,通过基因芯片分析在Fbxl5-MO和Std胚胎样品的mRNA含量差异.所得结果显示获得了较高效价和特异性好的斑马鱼Fbxl5多克隆抗体,为Fbxl5功能的进一步研究奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 EspA和EspB蛋白的重组表达及其免疫效果

目的：通过DNA重组技术表达肠出血性大肠杆菌（EHEC）0157：H7的EspA和EspB蛋白,并分析它们的免疫保护性。方法：采用PCR技术从EHEC0157：H7基因组中扩增espA和espB基因,连接至pET-22b（4-）载体上,转化至宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达,用亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE测定其相对分子质量,免疫小鼠分析其免疫保护性。结果：重组espA和espB基因片段的测序结果与GenBank中的相应基因序列完全一致,一致性均为100％;得到了纯度为95％以上的重组EspA和EspB蛋白,免疫小鼠所得到的抗体效价均为10^6。结论：重组EspA和EspB蛋白获得了可溶性表达,表达的蛋白具有良好的免疫保护性,为进一步制备疫苗奠定了基础。     

功能性包涵体的研究进展

利用原核系统表达外源重组蛋白的一个特点是表达蛋白多以包涵体形式存在。在过去人们一直认为包涵体是错误折叠、无生物活性的蛋白,需要经过变复性的过程重新获得有生物活性、可溶的蛋白,因而变复性条件的摸索迄今仍然是该领域的难点。但近几年的研究表明包涵体并非都是无生物活性的,功能性包涵体(或者称为非传统意义包涵体) 概念的提出是该领域的一个重大研究进展。由于功能性包涵体本身具有生物活性,可在非变性条件下提取,目前已经在生命科学的基础研究、生物制药、生物材料、生物催化等领域展现出良好的应用前景。重点从功能性包涵体的定义、形成机理、提取条件等近期研究进展进行综述,以期为原核细胞表达和工业生产重组蛋白药物提供新的思路。     

巴中地区上消化道出血反复发作相关性因素分析

目的：了解巴中地区上消化道出血反复发作的原因,为治疗提供临床循证医学证据。方法：通过对2011年4月~2012年11月巴中地区1134例上消化道出血中132例反复发作的患者进行调查统计,分析这上消化道出血反复发作的132例患者的年龄、生理特征、生活饮食习惯、精神状态、生活压力等多种相关因素。结果：发现饮食不当、精神紧张、腹腔感染、腹腔内压增高、输液输血过速、过量等是造成病情反复发作的主要诱因。结论：通过消除疾病的诱发因素,认真做好健康教育指导,积极治疗原发病是预防反复发作的有效措施。     

载多西紫杉醇脂质微泡对人肝癌HepG2细胞抑制作用的体外研究

目的：观察自制载多西紫杉醇脂质微泡联合超声对人肝癌HepG2细胞的抑制作用。方法：通过薄膜分散法制备载多西紫杉醇脂质微泡,观察其形态,测定粒径大小、包封率、载药量及稳定性等性质;将人肝癌HepG2细胞随机分为5组,对照组、多西紫杉醇组（DOC组）、多西紫杉醇联合超声组（DOC＋US组）、载多西紫杉醇脂质微泡组（DLLM组）、载多西紫杉醇脂质微泡联合超声组（DLLM＋US组）,CCK-8法检测细胞毒性,倒置显微镜观察细胞凋亡的形态,DAPI荧光染色法观察凋亡细胞核的改变。结果：载多西紫杉醇脂质微泡形态光滑圆整,无黏连;粒径分布范围为170~590 nm,平均粒径为350 nm;Zeta电位为-5.2 mV;微泡的包封率为80.0%,载药量为18.5%;4℃条件下保存14天性质稳定;DLLM＋US组较其他各组对肿瘤细胞有更为明显的抑制增殖及诱导凋亡效应（P〈0.01）。结论：自制载多西紫杉醇脂质微泡粒径小,包封率高,稳定性好,此微泡联合超声对人肝癌HepG2细胞有明显抑制作用,载多西紫杉醇脂质微泡有望成为一种新型抗肿瘤给药途径。     

鲍曼不动杆菌体外诱导耐药及其诱导前后交叉耐药和呼吸耗氧率分析

【背景】鲍曼不动杆菌是院内感染的重要病原菌,因其耐药率高、治疗难度大而备受关注。然而,对于该菌的交叉耐药及耐药相关因素尚未完全阐明。【目的】通过体外诱导分别获得耐美罗培南或耐替加环素的鲍曼不动杆菌菌株,并研究其诱导前后的交叉耐药性和细菌呼吸耗氧率差异。【方法】采用多步法对鲍曼不动杆菌ATCC19606进行体外诱导耐药,PCR扩增诱导前后菌株的16S rRNA基因并测序鉴定,微量肉汤稀释法检测诱导前后鲍曼不动杆菌对美罗培南、亚胺培南、替加环素、阿米卡星、头孢吡肟及左氧氟沙星等抗菌药物的最低抑菌浓度变化,Seahorse XF~e96细胞能量代谢实时测定仪对诱导前后菌株的耗氧率进行分析。【结果】通过88d的体外诱导实验,分别获得耐美罗培南或耐替加环素的鲍曼不动杆菌ATCC19606菌株。耐美罗培南鲍曼不动杆菌ATCC19606对替加环素、亚胺培南、阿米卡星、左氧氟沙星仍处于敏感状态,但是对头孢吡肟交叉耐药;耐替加环素鲍曼不动杆菌ATCC19606对美罗培南、亚胺培南、阿米卡星、左氧氟沙星及头孢吡肟仍处于敏感状态。鲍曼不动杆菌ATCC19606被美罗培南或替加环素诱导耐药之后的耗氧率均下降,差异均具有统计学意义。【结论】美罗培南的使用不仅可能诱导鲍曼不动杆菌ATCC19606对美罗培南耐药,也可能会导致该菌对其它一种或几种抗菌药物产生交叉耐药。鲍曼不动杆菌ATCC19606对美罗培南或替加环素耐药后其耗氧率下降,从而说明呼吸耗氧率下降可能是该菌耐药的因素之一。     

松墨天牛漆酶基因MaLac1的克隆、原核表达及表达谱分析

【目的】本研究旨在克隆并鉴定松墨天牛Monochamus alternatus内源漆酶基因MaLac1,分析其在松墨天牛不同发育阶段的表达水平,为进一步明确MaLac1功能提供依据。【方法】基于松墨天牛肠道转录组测序数据,通过RACE克隆松墨天牛MaLac1基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;将该基因与pET-32a载体链接构建表达载体pET-MaLac1,导入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)使其表达;使用qPCR检测MaLac1基因在松墨天牛不同发育阶段(低龄幼虫、老熟幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫)肠道中的表达差异。【结果】克隆获得松墨天牛MaLac1的cDNA全长序列(GenBank登录号:KY073340)。MaLac1开放阅读框全长2 067 bp,编码一个含688个氨基酸的蛋白质,预测分子量为78.34 kD,等电点为5.30。SignalP 4.1 Server预测MaLac1在N端包含一个15个氨基酸的信号肽。序列比对分析表明,MaLac1具有典型的昆虫漆酶基因特征,与赤拟谷盗Tribolium castaneum漆酶基因的氨基酸序列一致性达93%。SDS-PAGE检测发现IPTG诱导表达了一条大约78 kD的特异蛋白条带,与推测大小一致。qPCR结果显示,MaLac1在不同发育阶段的松墨天牛肠道中均有表达,其中,在雌成虫肠道中表达量最高,在雄成虫肠道中的次之,在幼虫肠道中的最低。【结论】MaLac1在松墨天牛成虫中表达量显著高于其在幼虫中的,这一结果可能与幼虫和成虫的取食习性差异相关。MaLac1在松墨天牛体内的功能还有待进一步研究。