谷氨酸棒杆菌碱基编辑的条件优化

近年来,基于CRISPR/Cas9的碱基编辑技术因其具有不产生DNA双链断裂、无需外源DNA模板、不依赖宿主同源重组修复的优势,已经逐渐发展成为一种强大的基因组编辑工具,在动物、植物、酵母和细菌中得到了开发和应用。研究团队前期已在重要的工业模式菌株谷氨酸棒杆菌中开发了一种多元自动化的碱基编辑技术MACBETH,为进一步优化该方法,提高碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中的应用效率,本研究首先在谷氨酸棒杆菌中构建了基于绿色荧光蛋白(GFP)的检测系统:将GFP基因的起始密码子ATG人工突变为ACG,GFP无法正常表达,当该密码子的C经编辑后恢复为T,即实现GFP蛋白的复活,结合流式细胞仪分析技术,可快速衡量编辑效率。然后,构建针对靶标位点的碱基编辑工具,经测试,该位点可成功被编辑,在初始编辑条件下碱基编辑效率为(13.11±0.21)%。在此基础上,通过对不同培养基类型、诱导初始OD600、诱导时间、诱导物浓度进行优化,确定最优编辑条件是:培养基为CGXII,初始OD600为0.05,诱导时间为20 h,IPTG浓度为0.01 mmol/L。经过优化,编辑效率达到(30.35±0.75)%,较初始条件提高了1.3倍。最后,选取原编辑条件下编辑效率较低的位点,进行了优化后编辑条件下的编辑效率评估,结果显示,不同的位点在最优编辑条件下的编辑效率提高了1.7–2.5倍,进一步证实该优化条件的有效性及通用性。研究结果为碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中更好的应用提供了重要的参考价值。     

基于转录组测序的Cd胁迫下芹菜细胞自噬相关基因的筛选

细胞自噬是植物逆境应答过程中最常见的保护机制之一。动物中,自噬相关基因抵御镉(Cd)毒害的功能研究较清楚,但植物却知之甚少。文中以芹菜品种‘皇后’为试材,采用外源Cd(终浓度为0、2、4、8mg/L)添加营养液水培处理,利用转录组测序(RNA-seq)技术筛选细胞自噬相关差异基因并进行q RT-PCR验证。结果表明Cd胁迫对芹菜植株产生了明显的毒害作用,并与浓度间产生了量效关系。在筛选的8个差异表达的自噬相关基因中,ATG8a、ATG8f、ATG13、AMPK-1、AMPK-2基因随Cd浓度升高表达上调,ATG12、VPS30和VPS34则先上调后下降,说明自噬相关基因可能通过表达上调增加了自噬小体结构以抵御Cd毒性作用;而高浓度Cd(8mg/L)可能超出芹菜的耐受范围,导致多个自噬基因又出现表达下调趋势。以上结果有助于后期自噬相关基因的功能研究,为进一步探讨芹菜对Cd胁迫的耐性机制提供参考依据。     

果胶甲酯酶的结构与功能研究进展

果胶甲酯酶(PME)是一种重要的果胶酶,其水解果胶中的甲酯基从而释放甲醇并降低果胶的甲酯化程度。目前在食品加工、茶饮料、造纸等生产工艺中有着广泛的应用前景。随着对PME的深入研究,已报道了几种不同来源的酶晶体结构,对这些已获得的晶体结构进行分析发现,PME属于右手平行β-螺旋结构,其催化残基为2个保守的天冬氨酸和1个谷氨酰胺残基,并且在催化过程中分别起到了一般酸碱、亲核试剂以及稳定中间体的作用。同时对其底物特异性进行分析,初步了解其底物与活性位点的识别机制。文中针对这几个相关方面进行了系统的综述。     

西南特有濒危植物大王杜鹃种群结构及动态特征

为了揭示高山杜鹃种群生存潜力和濒危原因,以西南特有濒危植物大王杜鹃(Rhododendron rex subsp. rex)为研究对象,通过对云南省轿子雪山和小百草岭2个大王杜鹃自然种群的野外植株胸径及数量的调查,采用空间代替时间的方法建立大王杜鹃种群的径级结构、静态生命表并绘制种群存活曲线,阐明其种群的结构特征,利用种群数量动态预测和时间序列预测来分析种群未来的发展趋势。结果表明：(1)云南轿子雪山和小百草岭两个样地大王杜鹃均表现出第Ⅰ~Ⅱ龄级个体不足的现象,尽管两个样地内大王杜鹃种群仍表现为稳定型种群,但其均对外界干扰具有很高的敏感性。(2)大王杜鹃存活曲线在云南轿子雪山和小百草岭2个样地都趋于Deevey Ⅱ型,个体平均生存能力的期望值均在幼年(Ⅰ和Ⅱ龄级)个体中最大,死亡率和消失率曲线的变化趋势基本一致。(3)时间序列预测分析表明,云南轿子雪山大王杜鹃种群在未来2、4、6年龄级后总体均呈下降趋势,种群面临衰退危险;小百草岭样地内,大王杜鹃种群总体上呈增长趋势,种群具有一定的恢复潜力。建议加强大王杜鹃自然种群生境的保护与管理从而维持其种群自然更新与发展的能力。     

珍稀植物连香树在其中国分布区北缘的种子性状及幼苗更新限制

连香树(Cercidiphyllum japonicum)是第三纪孑遗植物, 存在严重的幼苗更新限制。为验证生活史早期(种子萌发)限制中国分布区北缘连香树种群幼苗更新, 并探讨其主要成因, 本研究在秦岭和太行山脉采集不同种源地的种子, 测定其形态性状、营养元素含量和质量、不同贮存时间的活力及不同温度条件下的萌发性状, 通过方差分析、相关分析等方法对不同种源地的种子性状进行分析。结果表明: 在中国分布区北缘, 其种子长度(P < 0.001)、萌发率(P < 0.001)、平均萌发时间(P < 0.001)、氮(P < 0.05)和磷含量(P < 0.001)在不同种源间存在显著差异; 而在区域尺度上(秦岭与太行山), 仅种子碳含量存在显著差异(P < 0.01)。天水种群的种子萌发率最高(21.77%), 平均萌发时间最长(11.12 d); 栾川的萌发率最低(1.38%), 平均萌发时间最短(3.47 d)。在25℃条件下, 济源种群的种子萌发率显著高于10℃、15℃和20℃条件下(P < 0.05), 而其他种源地的萌发率在不同温度条件下无显著差异。在4个温度条件下, 栾川种群种子的初始萌发时间无显著差异, 而其他4个种源地的初始萌发时间都随温度升高而缩短。相关分析结果表明, 种子萌发率与种子活力密切相关, 而种子活力与种子质量、种子的氮和磷含量显著相关。在中国分布区北缘, 连香树种子的自身属性(质量、氮和磷含量)通过影响种子活力间接影响萌发率; 且种子萌发对温度的响应主要表现在萌发时间上。本研究证实种子萌发是限制连香树种群幼苗更新的关键阶段, 主要原因如下: (1)连香树种子在9月成熟后, 10月的温度仍适宜种子萌发, 但较短生长期的幼苗在冬季低温下不能存活; (2)连香树种子萌发率低(14.4%); (3)第二年春天种子活力骤降。     

不同水肥一体化方式对苹果氮素吸收利用特性及产量和品质的影响

以‘嘎啦/八棱海棠’为试材,借助¹⁵N同位素示踪技术,研究了撒施(T₁)、滴灌施氮(T₂)和渗灌施氮(T₃)对嘎啦苹果氮素吸收利用、分配特性和产量品质的影响,以期进一步完善苹果园水肥一体化技术,挖掘提高氮素利用率的途径。结果表明: T₃处理苹果叶片的叶面积、叶绿素和氮含量显著高于T₁和T₂处理。各时期土壤矿化氮(N_min)含量在20~40 cm土层表现为T₃＞T₂＞T₁处理,在0~20 cm土层表现为T₂＞T₃＞T₁处理。同一器官的Ndff值(树体各器官从肥料中吸收到的¹⁵N占该器官全氮量的比例)在各时期均以T₃处理最高,T₂其次,T₁处理最低。果实成熟期的树体¹⁵N利用率表现为T₃＞T₂＞T₁处理,其中T₃处理的树体¹⁵N利用率为24.2%,分别是T₂和T₁处理的1.19和1.65倍。果实成熟期T₁处理的¹⁵N分配率在营养器官最高,T₂处理在贮藏器官最高,T₃处理在生殖器官最高。各处理的单果重、产量、可溶性固形物、硬度、可溶性糖及糖酸比均以T₃处理最高,T₂其次,T₁处理最低。渗灌施氮处理显著促进了嘎啦苹果树体叶片生长和氮素利用,并提高了果实产量和品质。     

中国特有植物雪落樱桃潜在分布及其生态特征

为明确中国特有植物雪落樱桃(Cerasus xueluoensis)的潜在分布与居群生态特征,利用DIVA-GIS软件及其耦合的BIOCLIM模型,首次绘制了雪落樱桃适生区分布模拟图,并对影响其分布的主导气候因子进行了定性定量分析。结果表明,雪落樱桃当前潜在适生区主要分布在亚热带长江流域1 200 m以上高海拔山区,其中渝-鄂-湘三省交界的大巴山-巫山山脉可视为现代核心分布区,湘黔交界及湘南的南岭山脉可视为雪落樱桃潜在分布的南界,陕-豫-鄂交界山区的秦岭南麓可能是其潜在分布的北界。主成分分析(PCA)筛选的主导气候因子及其贡献率依次为:年降水量(bio12)最冷季降水量(bio19)最暖季降水量(bio18)最湿季降水量(bio16),累计频率曲线进一步确定其适宜范围分别为:993.00～1 870.22、500.00～680.00、430.00～669.16和500.00～680.00mm,表明降水是影响雪落樱桃当下分布格局的主导气候限制因子。Pearson相关性分析表明,雪落樱桃分布格局在区域尺度上受海拔、经、纬度影响;最小树分析和聚类分析表明,雪落樱桃7个野生居群可划分为中西部与东部两大分支;受试者工作特征曲线(ROC) AUC值达到0.751,满足模型预测精度的基本要求。这些有助于为雪落樱桃制定科学合理的资源保护与科学引种规划。     

云南48种木兰科野生植物资源遗传多样性研究

为了解云南省木兰科（Magnoliaceae）野生植物资源的遗传多样性,利用ISSR分子标记技术对48种木兰科野生植物资源进行研究。结果表明,10对引物共扩增出151条带,均为多态性条带,多态性条带百分率为100%。总的观测等位基因数（N_a）为2.000 0,有效等位基因数（N_e）为1.564 5,Nei’s基因多样性指数（H）0.337 9,Shannon’s信息指数（I）为0.510 1。总的基因多样性指数（H_t）为0.368 0,属间基因多样性指数（D_st）为0.251 9,占68.4%,基因分化系数（G_st）为0.684 0,基因流（N_m）为0.231 0。UPGMA聚类分析将48种木兰科植物划分为7个类群,各类群并非按照属聚在一起,而是不同属植物相间分布,长喙厚朴（Magnolia rostrata）、素黄含笑（Michelia flaviflora）和球花含笑（M.sphaerantha）可能为云南省木兰科植物中的原始种。48种木兰科野生植物总体具有较高的遗传多样性,但属间遗传变异较高,基因流较小,存在遗传漂变的风险,聚类结果与刘玉壶的分类系统存在分歧,这从分子水平为木兰科植物间的起源、进化与分类提供了重要依据。     

侵袭性真菌深部感染的早期实验室诊断

目的探讨假丝酵母菌甘露聚糖抗原和假丝酵母菌IgG/IgM抗体、曲霉半乳甘露聚糖抗原和烟曲霉IgG抗体在侵袭性真菌病早期临床诊断中的应用价值。方法收集已确诊侵袭性假丝酵母菌病患者18例,侵袭性烟曲霉病患者6例,单纯细菌感染患者20例,浅部真菌感染患者20例,健康体检者(正常对照组)20例,通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清甘露聚糖和假丝酵母菌IgG/IgM抗体以及曲霉半乳甘露聚糖抗原和烟曲霉IgG抗体浓度,计算各指标的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和受试者工作特征(ROC)曲线下面积。结果甘露聚糖抗原和假丝酵母菌IgG/IgM抗体联合测定的敏感度为66.7%,特异度为83.3%,阴性预测值为100.0%,阳性预测值为85.7%,ROC曲线下面积为0.992(95%CI:0.974~1.000);半乳甘露聚糖抗原和烟曲霉IgG抗体联合测定的敏感度为66.7%,特异度为95.0%,阴性预测值为98.2%,阳性预测值为100.0%,ROC曲线下面积为0.978(95%CI:0.934~1.000)。结论甘露聚糖抗原和假丝酵母菌IgG/IgM抗体、半乳甘露聚糖抗原和烟曲霉IgG抗体联合检测对深部真菌感染的早期诊断具有重要意义。