嗜热革节孢多糖单加氧酶氧化方式

多糖单加氧酶(polysaccharidemonooxygenase,PMO)是一种铜离子依赖的氧化酶,属于辅助活性酶类第九家族(auxiliary activity 9,AA9),在存在电子供体维生素C(vitamin C,Vc)的情况下,可以氧化裂解纤维素的多糖链,显著提高纤维素的酶解效率。本文克隆了嗜热革节孢Scytalidium thermophilumAA9家族的一个编码基因pmo7651,并在毕赤酵母GS115进行诱导表达,通过His标签获得了重组蛋白PMO7651-His。以磷酸膨胀纤维素(PASC)为底物进行酶促反应,薄层层析法(TLC)结果显示PMO7651酶解产物主要为纤维二糖至纤维五糖;飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)和溴氧化法确定PMO7651具有C1、C4、C6位的氧化活性;底物结合平面的3个芳香族氨基酸位点突变对酶的活性具有不同程度的影响;在PMO7651帮助下,纤维素酶的降解效率均具有不同程度的提高。     

外源H2O2对盐碱混合胁迫下裸燕麦幼苗生长和抗性生理的影响

为探讨信号分子过氧化氢（H₂O₂）增强裸燕麦盐碱耐性的作用及其生理机制,以裸燕麦品种‘定莜6号’为材料,在日光温室内用珍珠岩培养幼苗至三叶一心期时叶面喷施0.01 mmol·L^-1 H₂O₂的同时根部浇灌75 mmol·L^-1盐碱混合溶液（NaCl：Na₂SO₄：NaHCO₃：Na₂CO₃=12：8：9：1）或添加H₂O₂淬灭剂二甲基硫脲（DMTU）,研究对幼苗生长及叶片光合色素含量、活性氧代谢和渗透调节物质积累的影响。结果表明：喷施H₂O₂能够缓解盐碱混合胁迫对裸燕麦幼苗生长的抑制,提高幼苗根长、株高和植株干重及叶片叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素含量和超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶活性,降低超氧阴离子、H₂O₂、丙二醛、抗坏血酸、谷胱甘肽和游离氨基酸含量,促进抗氧化物质类黄酮、总酚和原花青素及渗透调节物质可溶性蛋白质、可溶性糖和脯氨酸积累。添加DMTU部分或完全逆转了H₂O₂的上述作用。采用隶属函数综合评价显示,喷施H₂O₂提高了盐碱混合胁迫下裸燕麦幼苗的综合评价值D,添加DMTU完全逆转了H₂O₂对D值的提升作用。表明外源H₂O₂通过参与活性氧代谢和渗透调节物质积累等生理代谢调控缓解盐碱混合胁迫诱导的氧化伤害和生长抑制,从而提高裸燕麦对盐碱胁迫的适应能力。     

常春二乔玉兰春夏季开花节律及营养效应研究

为系统掌握常春二乔玉兰春夏季开花物候节律,探讨其与营养物质的关系,本研究以6年生常春二乔玉兰为试验材料,观测其年生长发育节律、春夏季开花物候特性以及茎段营养物质的含量变化。结果表明：（1）每年12月始至翌年2月下旬为常春二乔玉兰休眠期。2月下旬花芽膨大生长,并于3月开始春季开花,花期持续约20 d。4月进行营养生长,5月完成花芽分化。5月底部分花芽膨大并于6月开始开花,夏季花期持续约20 d。7~9月为未膨大花芽的发育滞缓期。此外,少量夏季开放的花的基部侧芽再次分化形成花芽。10~12月随着落叶的开始,树体逐渐进入休眠期。（2）常春二乔玉兰营养生长后分化的花芽能够花开两季。春季开花为先花后叶,开花率为100%,开花同步率较高,雌、雄蕊发育正常,为可育花。夏季开花为花叶同放,开花率约为30%,且开花同步率较低,开放的花内雌、雄蕊发育异常,为不育花。（3）春季开花期间可溶性糖和可溶性蛋白呈下降趋势,淀粉含量于开花后期下降;夏季开花期间可溶性糖和淀粉总体呈先降后升趋势,而可溶性蛋白总体呈下降趋势。综上所述,常春二乔玉兰春、夏季开花期内开花模式存在一定差异,其显著节律特征与营养物质含量变化有关,推测低水平的可溶性糖及高水平的淀粉和可溶性蛋白有利于春季开花的启动,而低水平的可溶性蛋白及高水平的可溶性糖和淀粉含量则有利于夏季开花的实现。     

基于定量蛋白质组学的NT-89抗白念珠菌作用机制研究

目的利用定量蛋白质组学iTRAQ技术,分析抗真菌化合物NT-89作用后白念珠菌蛋白质组的含量变化。方法提取NT-89作用前后的白念珠菌总蛋白与细胞壁蛋白,利用iTRAQ技术检测蛋白提取物中蛋白质的相对丰度,寻找药物作用前后的差异蛋白,并利用GO数据库注释蛋白质功能分类。结果总蛋白(TP)提取物中检测出295种差异蛋白,其中的Ywp1p、Pga10p在总蛋白中含量下调最为显著。细胞壁蛋白(CWP)提取物中有6种GPI锚定蛋白含量显著降低。结论 NT-89影响了白念珠菌细胞壁的结构完整与功能,iTRAQ技术能够为药物的作用机制研究提供有效参考信息。     

脓毒症患者血清TOLL样受体4、脂联素与炎症反应和病情严重程度的关系

目的:探讨脓毒症患者血清TOLL样受体4(TLR4)、脂联素(APN)与炎症反应和病情严重程度的关系。方法:选取2016年12月到2018年4月期间在重庆市中医院接受治疗的脓毒症患者60例作为研究组,另选取同期本院健康体检者60例作为对照组。根据急性生理及慢性健康状况Ⅱ(APACHEⅡ)评分将脓毒症患者分为高分组17例(APACHEⅡ评分≥20分)和低分组43例(APACHEⅡ评分20分)。比较两组血清中的TLR4、APN、降钙素原(PCT)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)水平,比较高分组和低分组患者血清中的TLR4、APN及炎症因子水平,分析脓毒症患者TLR4、APN的表达与炎症因子、APACHEⅡ评分的相关性。结果:研究组血清中的TLR4、PCT、TNF-α、CRP水平均明显高于对照组,APN水平明显低于对照组(P0.05)。高分组患者血清中的TLR4、PCT、TNF-α、CRP水平明显高于低分组,APN水平明显低于低分组(P0.05)。脓毒症患者TLR4的表达与PCT、TNF-α、CRP、APACHEⅡ评分呈正相关,APN的表达与PCT、TNF-α、CRP、APACHEⅡ评分呈负相关(P0.05)。结论:脓毒症患者病情越严重,TLR4水平越高,而APN水平越低,TLR4、APN可能是通过调节炎症反应来影响脓毒症患者的疾病进展。     

独行菜族8属(十字花科)植物果实及种子微形态研究

采用GMA(Glycol methacrylate,乙二醇甲基丙烯酸酯)半薄切片法,利用比较解剖学对独行菜族中代表植物8属25种果实及种子微形态结构进行观察分析。同时,以菥蓂属菥蓂为例详细介绍了假隔膜的形成过程。结果显示独行菜族果实及种子微形态特征明显,果实均为短角果,除厚壁荠属和沙芥属果实为背腹压扁外,其他属种均为两侧压扁;果实边缘有翅为独行菜族的典型特征,可分为周翅、微翅、宽翅及披针形翅;部分果皮细胞有纤维层,偶有木化,除菘蓝属、厚壁荠属、沙芥属无假隔膜结构外,其他属种均具有明显的假隔膜。种子大小为(0.8~10)mm×(0.5~2.8)mm,种皮纹饰丰富,遇水或潮湿环境可形成粘液种子。种皮通常由薄壁细胞构成,偶有木化,具内含物;除高河菜属和菥蓂属子叶与胚根的排列方式为子叶缘倚,其他属种均为子叶背倚。假隔膜为内果皮细胞向内延伸连接而成。本文完善了独行菜族果实及种子微形态结构信息,为分子系统学等其他相关研究提供基础资料。     

宫颈癌患者新辅助化疗前后miR-138的表达及与化疗敏感性的关系研究

目的:研究宫颈癌患者新辅助化疗前后微小RNA-138(mi R-138)的表达及与化疗敏感性的关系。方法:选取2016年2月至2018年7月我院收治的宫颈癌患者18例为研究对象。所有患者均给予新辅助化疗,并根据治疗后的效果分为化疗有效组与化疗无效组。采用微阵列芯片技术分别检测两组患者化疗前后的mi R-138表达水平,同时采用Western blot技术检测mi R-138基因靶蛋白γH2AX的表达情况,分析患者化疗后mi R-138表达水平与临床病理特征的关系。结果:化疗有效组化疗后mi R-138△Ct值明显低于化疗前,且明显低于化疗无效组(P0.05),而化疗无效组化疗后mi R-138△Ct值与化疗前比较差异无统计学意义(P0.05)。化疗后两组靶蛋白γH2AX相对表达量均明显低于化疗前(P0.05),化疗有效组靶蛋白γH2AX相对表达量的差值显著低于化疗无效组(P0.05)。宫颈癌患者新辅助化疗后组织中mi R-138△Ct差值与肿瘤分化程度、浸润深度和淋巴结转移密切相关(P0.05),与年龄、FIGO临床分期无关(P0.05)。结论:新辅助化疗可以改变宫颈癌患者的mi R-138表达水平,且mi R-138的表达水平可能与化疗药物敏感性密切相关。     

小檗碱通过抑制经典的NLRP3炎症小体活化通路来下调LPS诱导的HUVEC炎症反应*

目的:探讨小檗碱(Berberine, Ber)对脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导的人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical VeinEndothelial Cells, HUVEC)炎症反应的抑制作用及相关机制。方法:MTT法检测不同浓度的Ber对HUVEC存活率的影响。以0.05μg/mL LPS刺激HUVEC建立炎症反应模型,并分别给予1.25、2.5、5μM Ber干预,Elisa检测Ber对炎症因子TNF-α、IL-1β分泌的影响,免疫印迹法检测Ber对NLRP3炎症小体信号通路中NLRP3、My D88、IL-1β、TLR4、ASC和Caspase-1蛋白表达的影响。结果:不同浓度的Ber对HUVEC增殖均具有抑制作用,且基本呈现浓度梯度,IC50值接近5μM;与LPS组相比,不同浓度Ber(1.25、2.5、5μM)均可以显著下调HUVEC中TNF-α、IL-1β炎症因子的分泌(P0.005及P0.01),并可以显著抑制细胞中NLRP3、My D88、IL-1β、TLR4、ASC和Caspase-1蛋白的表达(P0.05),其抑制作用基本呈剂量关系,以5μM Ber的抑制效果最佳。结论:Ber可以通过抑制经典的NLRP3炎症小体活化通路来下调LPS诱导的HUVEC炎症反应。     

5例前列腺癌T细胞受体β链CDR3的多样性分析

T淋巴细胞受体(TCRs)在抗原识别免疫应答中作用重要,其多样性与宿主免疫反应及肿瘤预后判断密切相关。目的:采用高通量测序技术研究前列腺癌组织和癌旁组织中T细胞受体(TCR)克隆多样性及其克隆序列。方法:收集5例PC患者的癌组织和癌旁组织,提取DNA后经多重PCR技术对TCRβ链CDR3区进行扩增。用Illumina MiSeq进行测序,经过数据处理和比对分析,比较前列腺癌组织TCR CDR3组库的组成特征。结果:前列腺癌组织具有更高程度的克隆百分比和较高的高度扩增克隆比HEC(HEC:频率样本总读数的0. 5%的TCR克隆),并获得了24对在癌组织样本中差异表达的V-J基因组合、16对在癌旁组织样本中差异表达的V-J基因组合。结论:前列腺癌组织与癌旁组织均存在差异性的V-J基因组合以及高克隆表达的HEC,其中癌组织样品具有更高的HEC。PC发生发展对免疫学研究提供了新的数据,对PC免疫监视、T细胞受体变异标志等研究提供了参考,对以后继续研究打下了基础。     

构建重组枯草芽孢杆菌催化制备D-对羟基苯甘氨酸

目的: 在Bacillus subtilis中表达异源D-海因酶基因(hyd)和D-氨甲酰水解酶基因(adc),构建重组细胞作为催化剂,用于生产D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)。方法: 构建hyd表达质粒,考察培养基中二价金属离子对D-海因酶活性的影响。过表达acoR基因,考察AcoR蛋白胞内水平与P_acoA-hyd基因拷贝数的关系。筛选表达adc基因的启动子,构建hyd和adc基因共表达质粒,考察双酶活性菌株的催化特性。结果: 成功构建了海因酶表达质粒pHPS和pUBS,培养基中添加0.8mmol/L的MnCl₂·4H₂O,使168N/pUBS菌株的D-海因酶活性达到956U/gDCW。整合表达P_cdd-acoR基因,使LSL02/pUBS菌株的D-海因酶活性达到1 470U/gDCW。单拷贝P_AE-adc基因的表达水平相对最高。双酶共表达质粒pUBSC被成功构建,菌株LSL02/pUBSC的最适催化温度为40℃45℃,催化活性能够持续12h,当底物起始浓度为20g/L时,反应12h生成的D-HPG达到14.32g/L,转化率达到95%,收率超过80%。结论: 构建具有D-海因酶和D-氨甲酰水解酶双酶活性的重组Bacillus subtilis作为全细胞催化剂,用于海因酶法生产D-HPG,具有技术上的可行性和优势。