湖羊瘤胃微生物GH9家族葡聚糖酶基因IDSGLUC9-25的表达与功能表征

【目的】葡聚糖酶是饲用添加剂的重要成分,本研究旨在从湖羊消化道微生物中挖掘性质优良的GH9家族葡聚糖酶基因,用于研发新型饲用酶制剂。【方法】从湖羊瘤胃微生物cDNA中扩增IDSGLUC9-25基因,在大肠杆菌中进行异源表达,对重组蛋白进行诱导表达和纯化,研究重组蛋白的酶学性质和底物水解模式。【结果】IDSGLUC9-25基因编码527个氨基酸,包含一个CelD_N结构和一个GH9家族催化结构域;重组蛋白rIDSGLUC9-25分子量约为62.7 kDa,最适反应温度和pH分别为40℃和6.0,在30-50℃下活性较高,在pH 4.0-8.0范围内能够保持较高的稳定性,经pH 4.0-8.0缓冲液处理1 h后残余活性均大于90%;底物谱分析表明,rIDSGLUC9-25能催化大麦β-葡聚糖、苔藓地衣多糖、魔芋胶和木葡聚糖,比活性分别为(443.55±24.48)、(65.56±5.98)、(122.37±2.85)和(159.16±7.73) U/mg;利用薄层色谱法(thin layer chromatography, TLC)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)分析水解产物发现,rIDSGLUC9-25降解大麦葡聚糖主要生成纤维三糖(占总还原糖64.19%±1.19%)和纤维四糖(占总还原糖26.24%±0.12%),催化地衣多糖主要生成纤维三糖(占总还原糖78.46%±0.89%)。【结论】本研究报道了一种来自密螺旋体属细菌的内切β-1,4-葡聚糖酶IDSGLUC9-25 (EC 3.2.1.4),能高效催化多糖底物生成纤维三糖和纤维四糖,为研发饲用酶制剂和制备低聚寡糖建立基础。     

EFFECTS OF VASOACTIVE INTESTINAL PEPTIDE ON ACTIVITIES OF SUCCINIC DEHYDROGENASE AND ALKALINE PHOSPHATASE IN RAT HEPATOMA CELLS

Using cytochemical method,microspectrophotometry and image analysis,effects of va-soactive intestinal peptide(VIP)on activities of succinic dehydrogenase(SDH)and alkalinephosphatase(ALP)in rat hepatoma cells were studied in vitro.The results showed that thehepatoma cell expressed potent positive reactions of SDH and ALP,the positive positionswere located at the cell membranes and/or cytoplasm.Having been treated with VIP,ALPdecreased obviously in activity(P<0. 01,compared with hepatoma cells untreated by VIP).The sites of ALP activty were chiefly located at the cell membranes,particularly at the cell-cell contacts.Cultured rat hepatoma cells had intensive SDH activity in their cytoplasm.Compared with untreated eclls,there was no marked difference in the intensity of SDH activ-ity in VIP-treated hepatoma cells(P>0.05).     

体外重构STUB1介导α-1抗胰蛋白酶突变体Z蛋白泛素化修饰反应体系

α-1抗胰蛋白酶Z型突变体蛋白(α-1 antitrypsin Z-mutant protein, ATZ)是引发α-1抗胰蛋白酶缺陷症(α-1 antitrypsin deficiency, AATD)的主要原因,研究ATZ蛋白的泛素化修饰和降解对于治疗AATD具有重要意义。STUB1是一种重要的E3泛素连接酶,参与调节多种蛋白质的泛素化修饰。然而,STUB1是否参与ATZ的泛素化修饰尚未明确。本研究首先将ATZ和STUB1的编码基因克隆到pET28a质粒,构建了这2个蛋白的表达质粒。随后,将重组质粒转入大肠杆菌表达系统,在优化诱导条件实现了重组蛋白的异源表达。通过金属螯合亲和层析技术纯化得到目的蛋白,并通过蛋白质谱分析验证了其氨基酸序列的准确性。利用纯化的ATZ和STUB1重组蛋白,构建了一个体外泛素化修饰反应体系。实验结果显示,在ATP、E1泛素激活酶和E2泛素结合酶的协同作用下,STUB1成功催化了ATZ的泛素化修饰。本研究提供了一种体外获得Z型突变体ATZ纯化蛋白的方法,并确认了STUB1介导ATZ的泛素化修饰功能,推进了对α-1抗胰蛋白酶Z型突变体蛋白在细胞内降解过程的调控机制的理解。     

转录因子在植物干旱应激中的功能研究进展

转录因子是一种多功能蛋白,在感知应激信号、应答相应应激基因表达及传导应激信号中起着关键作用。干旱是影响植物生长发育的主要非生物胁迫之一。为了适应干旱环境,植物发展了复杂的分子机制,其中转录因子可同时控制多种途径调控干旱应激,是操纵调控和应激响应途径的有力工具。近年来,越来越多的植物转录因子的功能被阐明,了解转录因子在干旱应激的功能,对植物的工程抗旱有重要的实践意义。综述转录因子在植物干旱应激中的功能研究进展,以期为今后转录因子的研究和利用提供理论依据,培育具有较强抗旱能力的植物。     

NADH荧光法快速检测细菌总数

基于细菌胞内NADH的荧光特性及其在胞内含量稳定的特性, 建立一种快速检测细菌总数的新方法。该荧光法的NADH检测限为1 nmol/L, NADH含量在10 nmol/L~0.2 mmol/L间与荧光强度呈良好线性关系(R2 =0.9905)。经离心获得菌体细胞, 热Tris-HCl法提取胞内NADH, 以 342 nm为激发波长, 461 nm为发射波长测定提取液荧光强度, 1 h内可检测到样品1×104 CFU/mL菌数。结果表明该方法快速、灵敏、简便、重复性好, 可适用于食品卫生与安全、环境检测等领域活细菌数量的定量检测。     

PNAS-4 expression and its relationship to p53 in colorectal cancer

PNAS-4 is a novel pro-apoptotic protein activated during the early response to DNA damage; however, the molecular mechanisms and pathways regulating PNAS-4 expression in tumors are not well understood. We hypothesized that PNAS-4 is a p53 down-stream target gene and designed this study. We searched online for putative p53-binding sites in the entire PNAS-4 gene and did not find any corresponding information. In HCT116 colon cancer cells, after being transfected with small interfering RNA to silence p53, the expressions of PNAS-4 and other known p53 target gene (Apaf1, Bax, Fas and Dr5) were determined by real-time PCR. We found that PNAS-4 was up-regulated while Apaf1, Bax, Fas and Dr5 were down-regulated. We then examined the expression of PNAS-4 and p53 mutation in colorectal cancer patients. PNAS-4 expressed both in colorectal cancers and normal tissues, but compared with paired control, PNAS-4 was up-regulated in cancers (P = 0.018). PNAS-4 overexpression ratios were correlated to the p53 mutant status (P = 0.001). The mean PNAS-4 expression levels of p53 mutant homozygote group and heterozygote group were higher than that of p53 wild type group (P = 0.013). The expression ratios of PNAS-4 (every sample in relative to its paired normal mucosa) were different between negative lymph node metastasis (66% up-regulated, 34% down-regulated) and positive metastasis (42% up-regulated, 58% down-regulated). Taken together, these findings suggested that PNAS-4 was not a p53 target, but overexpression of PNAS-4 was correlated to p53 inactivity in colorectal cancer.     

地方认同视角下居民对农业文化遗产认知及保护态度——以福州茉莉花与茶文化系统为例

居民对农业文化遗产的认知态度影响其行为选择,并对农业文化遗产的保护及可持续发展具有重要意义。基于人文地理学及环境心理学领域的地方认同理论,选择历史认同、现实认同、情感认同及行为认同4个维度变量,通过问卷调查,以福州居民对全球重要农业文化遗产"福州茉莉花与茶文化系统"的认知及保护态度作为研究对象,并通过构建福州居民农业文化遗产认知及保护规律定量分析居民认知态度、保护行为与人口特征之间的关系。结果表明:(1)福州居民对茉莉花与茶文化系统的行为认同维度得分高于其他维度,且福州市民各维度得分均高于外来居民;(2)受访居民对农业文化遗产的地方认同与其年龄、受教育水平、收入水平及在福州居住时间长短的关系较为密切;(3)通过构建福州居民农业文化遗产认知及保护规律发现,福州居民对农业文化遗产的保护行为主要受其对该遗产项目认知态度的影响,与居民人口特征相关性较弱。拓展农业文化遗产领域的研究视角及方法,促进农业文化遗产地动态保护与可持续发展具有参考价值。     

水稻条纹病毒两个分离物RNA4基因间隔区的序列比较

通过RT-PCR扩增了我国水稻条纹病毒(RSV)山东济宁(JN)、云南宜良(YL)两个分离物RNA4基因间隔区(intergenic region,IR)序列,并克隆于pGEM-T easy载体上.序列分析结果表明:JN、YL两分离物RNA4 IR均由654个核苷酸组成,两者之间的同源率为92%.JN、YL两个分离物RNA4 IR在AU碱基富集处可形成两个明显的发夹结构,其中一个序列比较保守,形成的发夹结构稳定;但另一个由于碱基变异导致所形成的发夹结构的稳定性在各个分离物中差异较大.这些结果说明了我国水稻条纹病毒存在明显的分子变异.     

2,4-二硝基苯酚对采后龙眼果皮脂氧合酶活性和膜脂脂肪酸组分的影响

以'福眼'龙眼(Dimocarpus longan Lour.'Fuyan')果实为材料,研究呼吸解偶联剂2,4-二硝基苯酚(DNP)对采后果皮脂氧合酶(LOX)活性、膜脂脂肪酸组分和细胞膜透性的影响及其与果皮褐变的关系.结果表明:DNP处理导致龙眼果皮细胞膜透性、LOX活性和褐变指数增加,膜脂脂肪酸组分中的棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)等饱和 脂肪酸的组分增加,亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)和花生一烯酸(C20:1)等不饱和脂肪酸的组分下降,脂肪酸不饱和指数和脂肪酸不饱和度下降.因此认为,DNP促进了龙眼果实果皮褐变可能是由于提高了LOX活性,促进了膜脂不饱和脂肪酸的降解而引起膜系统完整性受损,最终导致细胞膜结构的破坏,使酚酶与酚类物质接触而引起酚类物质氧化的结果.