林麝源支气管败血波氏杆菌FMDBb1株的分离鉴定及全基因组序列分析

[背景] 呼吸系统疾病是圈养麝常见疾病之一,其中部分由支气管败血波氏杆菌引起,但目前关于林麝源支气管败血波氏杆菌的研究甚少。[目的] 对分离自患病林麝鼻黏液的一株疑似支气管败血波氏杆菌进行分离鉴定和全基因组序列分析,为林麝相关疾病的防治奠定基础。[方法] 将病原菌纯化培养后,通过菌落形态和生化试验初步鉴定病原菌类型,然后进行药敏试验和小鼠致病性试验以观察其耐药和毒力表型,最后对其进行全基因组测序,通过平均核苷酸一致性（Average Nucleotide Identity,ANI）比对在全基因组水平进一步评估物种间的亲缘关系,并进行基因功能注释和遗传进化分析。[结果] 该病原菌经ANI分类属于经典波氏杆菌亚种,结合菌落形态和生化结果综合鉴定为支气管败血波氏杆菌,菌株命名为FMDBb1,药敏表型显示其对林可霉素、利福平及大多数β-内酰胺类抗生素耐药,对小鼠的半数致死量为8.55×10⁶ CFU。全基因组测序显示该菌基因组大小为5 133 936 bp,基因功能注释显示其拥有强代谢能力,基因组内检测到65个经典波氏杆菌毒力因子,以及1个粉霉素和1个利福平的靶向耐药基因,同时发现19个插入序列和1个噬菌体区域的存在。序列类型为ST33,克隆复合体类型为CC6,管家基因联合建树分析显示与分离于韩国短毛猫的KVNON-570株相似性最高。[结论] 研究分离了林麝源支气管败血波氏杆菌并对其进行了全基因组测序及分析,为该病原菌感染的防治提供了宝贵的信息。     

一株稀有海洋真菌Stachybotrys longispora FG216的De Novo测序及基因组学分析

【背景】长孢葡萄穗霉菌(Stachybotrys longispora) FG216是一株稀有海洋真菌,其次生代谢产物FGFC1具有纤溶活性。进行S. longispora FG216的基因组序列分析,将充实和促进海洋微生物功能基因和次生代谢产物合成生物学的基础研究和应用研究。【目的】解析S. longispora FG216的基因组序列,分析基因组生物功能和同源相似性关系,分析次生代谢产物纤溶活性化合物FGFC1的相关基因。【方法】基于Illumina HiSeq高通量测序平台对S. longispora FG216菌株进行De Novo测序,使用SSPACE、Augustus等软件进行组装、编码基因预测、基因功能注释、物种共线性分析以及预测FGFC1次生代谢产物合成基因簇。【结果】S. longispora FG216的基因组测序总长度为45622830bp,共得到605个Scaffold,GC含量为51.31%,注释预测得到13329个编码基因和169个非编码RNA。基因组测序数据提交至国家微生物科学数据中心(编号为NMDC60016264),其中13 053、8 422、8 460、7 714和2 847个基因分别能够在NR、KEGG、KOG、GO和CAZy数据库匹配到注释信息。比较基因组学分析发现,Stachybotrys具有保守性,核心基因占基因家族总数目的71.44%,S. longispora FG216与S. chlorohalonata IBT 40285的相似性最高;同时,预测得到101个次生代谢产物合成基因簇,其中18个基因簇与已知的化合物相匹配。通过antiSMASH预测,Cluster57是编码合成FGFC1母核结构异吲哚啉酮的基因簇,与S.chlorohalonataIBT40285中的基因簇相似度为40%。【结论】海洋稀有真菌S.longisporaFG216的基因组信息已上传至国家微生物科学数据中心公开使用,为Stachybotrys种属的研究提供了重要的参考意义,同时发现了S. longispora FG216次生代谢产物纤溶活性化合物FGFC1母核部分编码基因是Cluster 57。     

分别利用产甘油假丝酵母抗逆转录因子CgSTB5和CgSEF1对酿酒酵母菌株糠醛耐受改造

【背景】纤维素是生物转化解决能源问题的主要原料之一,其水解物中存在严重影响抑制菌株生长的糠醛,需脱毒才可应用于发酵,提高菌株耐受性是解决纤维素水解液实际生产应用的关键。【目的】酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是主要的纤维素水解液发酵工业菌株,但糠醛耐受性较低,通过分子改造获得具有高糠醛耐受性的菌株。【方法】利用新获得的产甘油假丝酵母(Candidaglycerinogenes)的相关抗逆转录因子CgSTB5、CgSEF1和CgCAS5,通过分子技术进行S.cerevisiae改造,考察其对酿酒酵母糠醛耐受性的影响,并尝试应用于未脱毒纤维素乙醇发酵。【结果】单个表达CgSTB5和CgSEF1的酿酒酵母,通过菌株点板实验表明菌株的糠醛耐受性提高25%以上,并且摇瓶发酵结果显示糠醛降解性能明显提高,生长延滞期明显缩短,S.cerevisiae W303/p414-CgSTB5的未脱毒纤维素乙醇发酵生产效率提高12.5%左右。【结论】转录因子CgSTB5和CgSEF1均能对提高酿酒酵母糠醛耐受性起到重要作用,并且有助于提高酿酒酵母菌株未脱毒纤维素乙醇发酵性能。     

一株肠膜明串珠菌的分离鉴定及其抑菌特性

[背景] 水产病原细菌严重威胁水产动物健康且制约水产养殖业发展,细菌性鱼病的有效防治成为水产养殖领域亟待解决的问题。[目的] 筛选对水产病原细菌有抑制效果的菌株,并研究其抑菌特性及其在水产细菌病害防治中的实际效果。[方法] 通过16S rRNA基因测序、构建系统发育树和生理生化鉴定确定筛选菌株的进化地位,通过乙酸乙酯萃取获得抑菌物质粗提物,通过偶氮酪蛋白法检测菌株胞外蛋白酶活力,采用结晶紫染色法对菌株的生物膜形成能力进行测定,通过浸浴攻毒模型确定所筛菌株对维氏气单胞菌的防治作用。[结果] 从泡菜发酵物中筛选出一株乳酸菌DH,经16S rRNA基因测序、发育树分析和生理生化鉴定确定其为肠膜明串珠菌,该菌分泌的胞外抑菌物质对鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、杀鲑气单胞菌、希瓦氏菌和维氏气单胞菌表现出抑菌效果,其抑菌物质能被乙酸乙酯萃取并且具有热稳定性。菌株DH能够显著抑制待测菌株的蛋白酶产量和生物膜形成能力,并且对维氏气单胞菌浸浴攻毒有防治作用。[结论] 肠膜明串珠菌DH通过分泌抑菌物质抑制水产病原细菌的生长,能够为细菌性鱼病的防治提供一定的理论和应用潜力。     

β-葡萄糖苷酶Bgl747的定向筛选、重组表达与酶学性质

【背景】β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,EC3.2.1.21)是3种纤维素酶中的重要成分之一。目前工业用纤维素酶大都来源于木霉等真菌,较少来源于细菌,而且在应用中还存在反应条件(温度、pH等)适用范围窄、酶活力较低、获取成本偏高等问题,这大大限制了β-葡萄糖苷酶的应用。从秸秆还田土壤细菌中筛选β-葡萄糖苷酶有极大地可能性筛选出酶学性质较好的酶,从而解决现存的工业问题。【目的】从土壤中筛选β-葡萄糖苷酶,通过基因重组、表达优化和蛋白纯化获得一株新型β-葡萄糖苷酶,探究其酶学性质,为其在工业上的应用奠定基础。【方法】利用功能筛选法从土壤中筛选出β-葡萄糖苷酶,全长为747 bp,命名为Bgl747,构建重组表达质粒pET-28a-Bgl747,以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌株,经IPTG诱导实现可溶性表达并优化表达条件,通过His标签蛋白纯化试剂盒纯化获得纯化酶,探究其酶学性质。【结果】β-葡萄糖苷酶Bgl747属于BglB超家族,分子量为27.23 kD,最适反应温度为45°C,最适p H 4.0;最佳诱导条件:当OD600为1.0,加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG,于37°C、220 r/min诱导10 h后β-葡萄糖苷酶Bgl747蛋白获得最高表达量1.82 mg/m L;底物为对硝基苯-β-D-半乳糖苷(p-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside,p NPG)时的比酶活225.07 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率Vmax分别为0.268mmol/L、547.23μmol/(L·min);1mmol/LK+、1 mmol/L和10 mmol/L Fe2+、30%甲醇、30%乙醇、1 mmol/L和10 mmol/L盐酸胍对酶活都有促进作用,30%TritonX-100及10 mmol/L SDS抑制其酶活效果较为明显;该酶受到产物葡萄糖的反馈抑制,葡萄糖浓度越高,抑制效果越明显,但当葡萄糖浓度为1 mol/L时,酶活仍保持50%以上。【结论】Bgl747反应温度范围较广且稳定,酶学性质优异,为其在纤维素降解等工业应用奠定基础。     

奇异变形杆菌中基因岛介导的多重耐药传播研究进展

奇异变形杆菌是导致医院内感染的重要条件致病菌,广泛分布于自然环境及人和动物的肠道中。基因岛是细菌染色体上约10-200 kb独立的DNA片段,能促进宿主细菌适应复杂多变的环境,与细菌适应性进化密切相关。近年来在奇异变形杆菌基因组中发现了多个与多重耐药密切相关的基因岛,包括沙门菌基因岛1及其相关基因岛、SXT/R391整合性接合元件、PmGRI1等,表明基因岛在奇异变形杆菌多重耐药形成和传播中具有重要作用。本文对奇异变形杆菌中与耐药相关基因岛的结构特征、传播机制、流行情况等进行综述,以期为奇异变形杆菌中多重耐药相关基因岛的深入研究提供参考。     

基于“抗疫精神”的“基因工程”课程思政教学设计与实践

课程思政是当前高校落实“立德树人”根本任务的重要形式。在抗击新型冠状病毒肺炎疫情中,中华民族同舟共济、守望相助,共同铸就了伟大的抗疫精神,为课程思政教学提供了最生动的元素。本文对“战疫”行动中的抗疫精神进行梳理和总结,将其内涵凝练为5项内容;以新型冠状病毒的“核酸检测、疫苗研制及其变异”中蕴含的“抗疫精神”为思政载体,甄选“基因工程”课程中对应的理论内容,开展聚焦抗疫精神的“基因工程”课程思政教学设计与实践研究,利用问卷法和深度访谈法对教学实施效果进行评价,旨在引导学生在学习专业理论知识的同时,感悟课程内容中蕴含的抗疫精神,并将其内化为价值追求,潜移默化中提升学生的思想意识和道德修养,同时为生物类其他专业课程思政教学提供参考和借鉴。     

生姜精油化学成分及其抗菌活性

【背景】随着耐药微生物种类的增多和耐药性增强,抗耐药微生物新药的发现已成为全球关注的问题。生姜精油是纯天然植物精油,是天然抗菌材料的优选。【目的】分析生姜精油的化学成分,研究生姜精油对常见条件致病菌抗菌活性的影响,并阐明其可能的抗菌机制。【方法】采用气相色谱/质谱技术(Gas Chromatography/Mass Spectrometry,GC/MS)对生姜精油的化学成分进行分析,利用牛津杯法、最小抑菌浓度法(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)、最小杀菌浓度法(Minimum Bactericidal Concentration,MBC)和生长曲线绘制法研究生姜精油的抗菌活性和抗菌动力学特征,并通过透射电镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)观察生姜精油对细菌超微结构的影响。【结果】生姜精油的化学成分主要为姜烯(22.014%)、β-倍半水芹烯(11.276%)、α-法呢烯(8.222%)、α-姜黄烯(6.854%)、姜酮(5.610%)、姜辣二酮(5.192%)、6-姜烯酚(4.670%)、桧烯(3.393%)和β-红没药烯(3.080%)等萜类物质。生姜精油对枯草芽孢杆菌的MIC和MBC分别为2.3μg/mL和4.6μg/mL;对表皮葡萄球菌及金黄色葡萄球菌的MIC均为9.2μg/mL,MBC均为18.4μg/mL;对肺炎克雷伯菌的MIC和MBC分别为18.4μg/m L和36.8μg/mL。生长曲线结果显示,生姜精油能延长细菌的生长停滞期、抑制细菌的生长速率。透射电镜结果表明,生姜精油能引起细菌细胞膜破损,致使胞内物质渗漏。【结论】生姜精油富含萜类化合物,具有中度的抗菌活性,能破坏细菌细胞膜的完整性,引起菌体损伤和死亡。本文有望更好地为有害微生物的防控提供新方法。     

环境有机碳源抑制食弧菌嗜盐噬菌弧菌(Halobacteriovorax vibrionivorans)的捕食生长

【背景】蛭弧菌类群(Bdellovibrio-And-Like Organisms,BALOs)的生长所需碳源主要来源于宿主菌,而环境中各类碳源对其生长的影响还有待探究。【目的】探究不同环境有机碳源对食弧菌嗜盐噬菌弧菌(Halobacteriovorax vibrionivorans)捕食生长的影响,为其后续捕食机制和微生物菌剂的应用研究提供理论基础。【方法】以溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)为宿主,采用96孔板测定细胞吸光度法和双层平板法测定不同糖类化合物、酵母提取物和胰蛋白胨对食弧菌嗜盐噬菌弧菌Y22捕食生长的影响,设置热致死宿主和活宿主、人工海水和Tris-HCl (25 g/L NaCl)培养体系的对比试验,结合菌株基因组信息分析,探索其可能的生长影响机制。【结果】食弧菌嗜盐噬菌弧菌Y22不具备转运外界糖类的相关基因,不能利用环境中的糖类物质作为碳源;宿主溶藻弧菌可以利用蔗糖、麦芽糖、甘露醇生长且产酸,降低人工海水混合培养体系的pH值,从而抑制菌株Y22的捕食;葡萄糖不仅可以改变人工海水混合培养体系的pH值,而且可影响宿主的细胞特性,抑制菌株Y22的捕食识别过程;宿主无法利用淀粉、α-乳糖生长,该类碳源不影响菌株Y22捕食生长。菌株Y22具有蛋白和多肽膜转运蛋白基因,可以通过分解并摄取宿主细胞蛋白质类物质以获取碳源和氮源。外源添加质量浓度为1-5 g/L酵母提取物和胰蛋白胨都会抑制菌株Y22捕食生长,抑制效果随浓度增加而加强,酵母提取物浓度超过4g/L、胰蛋白胨浓度超过5g/L,菌株Y22捕食现象几乎不可见,抑制效果最强。【结论】环境中糖类可通过影响宿主菌代谢产酸或细胞特性,从而影响食弧菌嗜盐噬菌弧菌的捕食生长。食弧菌嗜盐噬菌弧菌可以吸收利用环境中的蛋白或多肽,并因此抑制其捕食生长。该研究结果将为嗜盐噬菌弧菌捕食机制的进一步探究和嗜盐噬菌弧菌微生物菌剂的开发应用提供重要的理论基础。     

2017–2019年我国南方地区高致病性H5N6亚型禽流感病毒血凝素蛋白分子特征分析

【背景】自2014年以来,H5N6禽流感病毒在我国家禽和活禽市场持续进化,成为人类和动物健康的重大威胁。【目的】对2017-2019年中国南方地区93株高致病性H5N6禽流感病毒的HA基因进行分子进化分析。【方法】接种9-11日龄鸡胚分离核酸检测阳性的H5N6标本,运用下一代测序平台对病毒分离物进行全基因组测序,从NCBI和GISAID数据库下载参考序列,利用BLAST、MEGA6.1及Clustal X等软件进行序列分析。【结果】2017-2019年,从189份江苏省H5亚型禽类/环境标本和1名H5N6患者咽拭子标本中共分离到43株病毒,完成了33株H5N6病毒的全基因组测序。下载网上同时期中国其他地区流行的H5N6毒株序列,对总计93株H5N6病毒的HA基因进行分子进化分析。93株H5N6病毒中有78株属于Clade 2.3.4.4h,9株病毒属于Clade 2.3.4.4e,4株H5N6病毒属于Clade 2.3.4.4b,1株属于Clade 2.3.4.4f,1株属于Clade 2.3.4.4g。所有93株病毒HA蛋白的裂解位点含有多个碱性氨基酸,表明它们都属于高致病性禽流感病毒。所有93株病毒HA蛋白的Q222和G224位氨基酸没有发生突变,保留了禽类受体α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)结合特性;158位点丧失糖基化,同时124位出现一个新的潜在糖基化位点。【结论】2017-2019年间中国南方地区H5N6病毒进化活跃,具有明显的基因多样性,需要加强对病毒分子进化的监测。