构建重组枯草芽孢杆菌催化制备D-对羟基苯甘氨酸

目的: 在Bacillus subtilis中表达异源D-海因酶基因(hyd)和D-氨甲酰水解酶基因(adc),构建重组细胞作为催化剂,用于生产D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)。方法: 构建hyd表达质粒,考察培养基中二价金属离子对D-海因酶活性的影响。过表达acoR基因,考察AcoR蛋白胞内水平与P_acoA-hyd基因拷贝数的关系。筛选表达adc基因的启动子,构建hyd和adc基因共表达质粒,考察双酶活性菌株的催化特性。结果: 成功构建了海因酶表达质粒pHPS和pUBS,培养基中添加0.8mmol/L的MnCl₂·4H₂O,使168N/pUBS菌株的D-海因酶活性达到956U/gDCW。整合表达P_cdd-acoR基因,使LSL02/pUBS菌株的D-海因酶活性达到1 470U/gDCW。单拷贝P_AE-adc基因的表达水平相对最高。双酶共表达质粒pUBSC被成功构建,菌株LSL02/pUBSC的最适催化温度为40℃45℃,催化活性能够持续12h,当底物起始浓度为20g/L时,反应12h生成的D-HPG达到14.32g/L,转化率达到95%,收率超过80%。结论: 构建具有D-海因酶和D-氨甲酰水解酶双酶活性的重组Bacillus subtilis作为全细胞催化剂,用于海因酶法生产D-HPG,具有技术上的可行性和优势。     

猪肺炎支原体检测技术研究进展

猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一种存在于世界各地的严重危害养猪业的疾病,严重影响饲料报酬,造成巨大的经济损失。准确、敏感、快速的Mhp检测方法有助于了解Mhp在猪群的流行情况,进而采取相应的预防、治疗和综合防控措施。对国内外Mhp病原学、分子生物学和免疫学检测方法进行了综述,为科技工作者全面了解Mhp检测方法提供参考资料。     

诱导多能干细胞向雄性生殖细胞分化诱导物的研究进展

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是利用细胞重编程技术人工获得的与胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)功能类似的细胞,能分化成包括三胚层在内的所有细胞类型,并且规避了ESCs的伦理学争议和移植后的免疫排斥问题,具有十分广阔的应用前景。对iPSCs体外诱导为生殖细胞所用的诱导物及其诱导效果进行了综述,生殖细胞发育机制的研究有望促进未来生殖和发育技术的进步。     

PD-L1基因敲除小鼠构建及初步表型验证

目的 程序性死亡配体-1(PD-L1)是免疫调节途径的重要因子,是抗肿瘤免疫疗法中重要的靶标之一。利用CRISPR/Cas9技术成功构建PD-L1基因敲除小鼠模型,并初步分析其表型。方法 构建Cas9和sgRNA载体,并转录获得RNA,通过显微注射方式将RNA注射到C57BL/6小鼠受精卵中,经过鉴定获得F₀代阳性小鼠。F₀代小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配获得F₁代杂合子小鼠,再通过F₁代小鼠自交获得F₂代纯合子小鼠品系。随后通过Real-Time PCR和流式实验分别检测PD-L1基因在mRNA和蛋白质水平上的表达情况。结果 Real-Time PCR和流式实验检测结果显示与野生型C57小鼠相比,PD-L1纯合子小鼠的PD-L1 mRNA相对表达水平和细胞上的蛋白质表达均有显著性下降,仅测定到本底的信号,证实已成功构建PD-L1基因敲除小鼠品系,为PD-L1体内基因功能研究提供了新的小鼠模型。     

L-氨基酸脱氨酶的分子改造及其用于全细胞催化法生产α-酮戊二酸条件的优化

酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)是谷氨酸脱氨基的酮酸产物,作为一种重要的有机酸广泛用于食品、医药、精细化工等领域。为提高L-氨基酸脱氨酶全细胞催化法合成α-KG的效率及产量,首先通过优化全细胞催化剂制备条件及全细胞转化反应条件,包括发酵过程中的温度、诱导剂浓度、诱导剂添加时刻、诱导时间等;全细胞转化过程中的温度、pH、细胞量、转化时间。各个条件优化后以200g/L谷氨酸钠为底物时,产量最终提高了54. 9%,摩尔转化率为39. 6%。其次,通过定点饱和突变对L-氨基酸脱氨酶进行定向进化以提高其催化能力。经过多次突变、筛选,最优突变体E. coli BL21-pET-20b(+)-pm1152催化200g/L谷氨酸钠生成α-KG最高产量为100. 9g/L,摩尔转化率为64. 7%,较最初对照菌株提高了66. 3%。结果表明,条件优化和饱和突变可有效提高重组大肠杆菌全细胞转化合成α-KG的能力。     

中性粒细胞胞外诱捕网在矽肺中的作用研究

目的:通过构建二氧化硅诱导动物矽肺模型,探讨中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil nxtracellular traps,NETs)在矽肺中可能的作用。方法:将C57BL/6J雄性小鼠完全随机分为磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)组、脱氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonuclease Ⅰ, DNase Ⅰ)组、二氧化硅+PBS组、二氧化硅+DNase Ⅰ组。通过气管内滴注二氧化硅(0.2 g/kg)混悬液构建小鼠矽肺模型,PBS组与DNase Ⅰ组注入等体积的PBS。在二氧化硅(silicon dioxide,SiO_2)混悬液注入后的第0小时、10小时小鼠气管内注入DNase Ⅰ(5 mg/kg),以后DNase Ⅰ持续给药:5 mg/kg/day,直到SiO_2混悬液注入后的28天。二氧化硅(SiO_2)干预28天后,取各组小鼠肺组织与肺泡灌洗液,通过PicoGreen荧光染料检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中NETs水平,酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测BALF中转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)与炎症因子白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,HE染色和Masson染色观察肺组织的病理学变化,Western Blot检测肺组织中NETs特异性组分瓜氨酸化组蛋白3(citrullinated-histone3,Cit-H3)表达。结果:SiO_2干预28天后,与PBS组相比,二氧化硅+PBS组小鼠肺组织炎症损伤加重,BALF中促炎介质IL-1β、IL-6、TNF-α水平上升;肺组织发生纤维化,大量硅结节形成;肺组织中Cit-H3蛋白表达量增加,BALF中NETs水平显著升高。予以NETs抑制剂DNase Ⅰ进行干预后,肺组织NETs水平显著下降,二氧化硅诱导的肺部炎症损伤、纤维化显著减轻。结论:NETs水平升高可能介导了二氧化硅诱导的小鼠矽肺模型肺部炎症损伤与纤维化。     

黄连素通过SOCS1减轻Aβ淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞激活

目的:观察黄连素(Berberine,BBR)对暴露于Aβ淀粉样蛋白(βAmyloid,Aβ)中的小胶质细胞激活的影响,并明确细胞因子沉默蛋白1(Silencing of Cytokine Signaling Factor 1, SOCS1)是否参与了BBR对小胶质细胞激活的影响。方法:将N9小胶质细胞暴露于含5μM Aβ的培养基中模拟阿尔兹海默症(Alzheimer's,AD)中的小胶质细胞激活。随后,将细胞分为5组,分别为Control组、5μM的Aβ损伤组(Aβ)、BBR+Aβ组、SOCS1-siRNA干扰组(SOCS1-siRNA+BBR+Aβ)和乱序si RNA处理组(SC-si RNA+BBR+Aβ),细胞处理24 h后,采用Western blot检测细胞诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,i NOS)、SOCS1蛋白的表达,酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测细胞培养基内炎症因子的水平。结果:与正常培养的Control组相比,5μM的Aβ暴露24 h可显著增加细胞i NOS蛋白表达水平和肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα,TNF-α)、白细胞介素1β(Interleukin 1β,IL-1β)和IL-6的释放(P0.05),但并未对SOCS1蛋白表达产生显著影响(P0.05),5μM的BBR可显著降低i NOS表达和上述3种促炎症因子的释放(P0.05),并上调SOCS1蛋白表达,而SOCS1-siRNA可显著逆转BBR对i NOS和SOCS1蛋白表达及3种炎症因子释放的影响(P0.05)。结论:BBR可能通过SOCS1减轻Aβ淀粉样蛋白对小胶质细胞的激活。     

肾衰宁胶囊联合血液透析对慢性肾功能衰竭患者肾功能及血液流变学的影响

目的:探讨肾衰宁胶囊联合血液透析对慢性肾功能衰竭患者肾功能及血液流变学的影响。方法:选取中国医科大学本溪中心医院于2015年1月-2017年9月期间收治的慢性肾功能衰竭患者80例为研究对象。根据随机数字表法将患者分为对照组(n=40)与研究组(n=40),两组患者均给予血液透析治疗,研究组在此基础上联合使用肾衰宁胶囊治疗,疗程均为3个月。观察并比较两组患者治疗3个月后临床疗效及不良反应发生情况,比较两组患者治疗前、治疗3个月后血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、肾小球滤过率(eGFR)水平及全血高切黏度、全血低切黏度、血浆黏度、红细胞比容。结果:研究组患者总有效率为92.50%(37/40),高于对照组的67.50%(27/40),差异有统计学意义(P0.05)。两组患者治疗3个月后Scr、BUN水平较治疗前降低,且研究组低于对照组(P0.05);而两组患者治疗3个月后eGFR水平较治疗前升高,且研究组高于对照组(P0.05)。研究组患者治疗3个月后的全血高切黏度、全血低切黏度、血浆黏度以及红细胞比容均低于对照组(P0.05)。对照组不良反应发生率为7.50%,与研究组的10.00%比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:肾衰宁胶囊联合血液透析对慢性肾功能衰竭患者有较好的治疗效果,能够改善患者肾功能状况,同时稳定患者血液流变学,并且安全性较好。     

小鼠哮喘发作过程中相关炎症因子的动态变化

目的:研究实验性哮喘小鼠模型在诱导哮喘发作不同时间点外周血中细胞因子IL-13、Eotaxin、MCP-1和TNF-α以及肺部浸润的炎症细胞数量变化。方法:将25只健康6-8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分成模型组和对照组。利用卵清蛋白(OVA)诱导建立小鼠哮喘模型,模型组(Asthma)小鼠于第0、7天经腹腔注射卵清蛋白(OVA)致敏小鼠。第14-20天连续7天用1%OVA雾化激发小鼠哮喘发作,每次20 min,观察临床症状。正常对照组(Control)小鼠以0.9%NaCL代替0VA进行腹腔注射和雾化吸入。比较两组小鼠肺组织病理切片HE染色结果、肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞分类计数及细胞因子IL-13、Eotaxin、MCP-1和TNF-α的浓度变化。结果:模型组小鼠BALF中IL-13的水平在试验早期(致敏2天)即开始上升达68.9±4.34,此时Eotaxin和MCP-1未见明显升高;致敏7天时IL-13、Eotaxin和MCP-1均明显高于对照组,分别为88.3±3.39、67.4±4.24和38.9±3.1;激发1天组小鼠BALF中IL-13、Eotaxin和MCP-1浓度持续增高至最后一次激发后1天;而TNF-α在激发1天时出现明显升高达136.9±11.9,持续到最后一次激发后1天;从激发1天肺泡灌洗液染色显微镜下观察明以淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润为主。肺组织HE染色显示哮喘组小鼠气道上皮有不同程度脱落,支气管平滑肌显著增厚,血管周围水肿,炎性细胞浸润。结论:在哮喘发生过程中,IL-13水平在致敏初期即开始升高,随着继续给予OVA,Eotaxin和MCP-1水平呈现显著增高;并伴随越来越多炎症细胞在肺部浸润,TNF-α水平出现缓慢增高,进而加重哮喘发作。     

FGF-21抑制HSC-T6细胞活化的抗肝纤维化作用及其机制的研究

目的:探索成纤维细胞生长因子21(FGF-21)对肝星形细胞T6(HSC-T6)活化的作用及其作用机制。方法:1640+10%胎牛血清的培养基培养HSC-T6细胞,实验分为5组:正常对照组(Control)、模型组(Model 20 m M乙醇处理细胞12 h)、低剂量FGF-21组(LFGF-21,0.5μmol/L)、中剂量FGF-21组(MFGF-21,1.0μmol/L)和高剂量FGF-21组(HFGF-21,2.0μmol/L)。Real-time PCR检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)、基质金属蛋白酶-2(MMP2)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)和Notch2的m RNA水平,Western blot检测CollagenⅠ、α-SMA、MMP2、MMP9和Notch2的蛋白水平,ELISA检测IL-1β、TNF-α的蛋白水平。结果:模型组α-SMA、CollagenⅠ、MMP2、MMP9、IL-1β、TNF-α、Notch2的水平高于对照组(P0.05),HFGF-21组α-SMA、CollagenⅠ、MMP2、MMP9、IL-1β、TNF-α、Notch2的水平均低于模型组(P0.05)。结论:FGF-21可抑制Notch2的表达,抑制炎症反应,从而抑制HSC的活化,发挥抗肝纤维化作用。