不同番木瓜品种植株感染环斑花叶病毒后PAL、PPO、POD活性的变化

对不同品种番木瓜接种环斑花叶病毒后,测定植株苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)的活性变化,比较各品种的抗病性。结果表明,未接种的5个品种间PAL、PPO、POD活性差异较小,其酶活性水平次序为马来10号> 蜜红3号> 马来6号> 马来2号> 台农2号。接种后,5个品种的PAL、PPO、POD活性明显高于各对照水平,其中马来10号变化最突出,台农2号变化最缓慢。     

敲除Pofut1不影响胚胎干细胞向神经元分化

蛋白O-连接岩藻糖基转移酶1 (Pofut1)基因缺失可导致Notch分子无法与配体结合并启动信号传递. 为研究Pofut1基因对哺乳动物胚胎干细胞（ESC）向神经分化的影响,利用Pofut1基因敲除的胚胎干细胞与野生型胚胎干细胞,经体外培养诱导拟胚体（EB）分化为神经细胞,计数分化为神经细胞的比例,采用细胞免疫组化染色和real-time PCR等方法,分析神经细胞特异性标志分子的表达. 结果显示,Pofut1基因缺失后,对EBC生长没有明显影响,分化过程中形成的拟胚体数量明显增多,分化的神经样细胞以及神经标志物分子的表达也明显多于对照组;Notch信号缺失对小鼠胚胎干细胞生长无明显影响,但可以促进ES细胞向神经细胞分化.     

褐飞虱Nl15基因的克隆及功能分析

【目的】植食性刺吸式口器昆虫的唾液蛋白参与调控植物抗虫防御反应,影响其对寄主植物的适应性。本研究旨在通过克隆褐飞虱Nilaparvata lugens重要唾液蛋白基因Nl15,调查其时空表达模式,明确其在褐飞虱致害性中的作用。【方法】基于褐飞虱IR56种群转录组数据,用RT-PCR克隆褐飞虱基因Nl15 cDNA序列,并进行生物信息学分析。利用qPCR检测其在褐飞虱TN1和IR56种群不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和雌雄成虫)和雌成虫不同组织(头、胸、腹和足)中的表达模式。通过显微注射dsRNA对褐飞虱TN1和IR56种群的4龄若虫进行Nl15的RNAi,利用qPCR检测Nl15 RNAi后褐飞虱若虫中Nl15的相对表达量以及Nl15 RNAi后褐飞虱若虫取食3 d时水稻植株中防御相关基因(OsLecRK4, OsMPK10, OsWRKY24, OsLox, OsNPR1和OsGns5)的相对表达量,并生物测定Nl15 RNAi后褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量。【结果】克隆了褐飞虱Nl15 cDNA序列(GenBank登录号：OK181113),其开放阅读框长1 008 bp;预测编码335个氨基酸,理论等电点为7.54,分子量为38.7 kD,含有23个氨基酸的信号肽序列和一个糖基化修饰位点,不存在跨膜结构域和其他已知的功能域;Nl15与灰飞虱Laodelphax striatellus同源蛋白氨基酸序列一致性为45%。发育表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱各个发育阶段均表达,在3-4龄若虫中的表达量最高;组织表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱雌成虫头部中的表达量最高,且在IR56种群头部中的表达量高于在TN1种群头部中的。RNAi实验结果表明,与注射dsGFP的对照组相比,注射dsNl15的处理组中Nl15的表达量显著降低了89.5%,褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量均显著降低,上述6个水稻防御相关基因的表达量显著上调。【结论】褐飞虱IR56种群中的Nl15参与褐飞虱与水稻的防御与反防御分子互作。本研究为进一步阐述褐飞虱克服抗虫基因的机制及揭示昆虫与植物互作的分子网络提供了思路。     

蚊浓核病毒介导的人工内含子在蚊体内外的初步应用

根据人β-球蛋白基因第一内含子5′-端供位序列与免疫球蛋白重链可变区基因3′-端受位序列构建人工内含子,将人工内含子插入重组蚊浓核病毒质粒载体p7NS1-GFP中GFP融合表达的病毒非结构蛋白NS1的编码框内,构建成载体p7NS1-Intron-GFP,与辅助载体pUCA共转染蚊C6/36细胞系,荧光显微镜下观察细胞内GFP的表达情况。纯化、回收共转染后形成重组病毒与野生病毒,共感染白纹伊蚊二龄幼虫并观察幼虫体内GFP的表达情况。结果在C6/36细胞与蚊幼虫体内均观察到GFP的高效表达,证实人工内含子无论在蚊细胞系内还是在活体幼虫内均可正常行使其自我剪切的功能,未影响到下游蛋白GFP的表达。本研究为人工内含子在蚊虫细胞内的应用奠定基础,为蚊虫及其病原体相关基因工程技术提供新的策略。     

一种优化的测定过氧化氢酶活性的方法

建立了一种优化的化学发光技术测定过氧化氢酶(CAT)活性的方法,并用此法检测40只正常家兔红细胞中过氧化氢酶活性为6.421±1.43K/gHb.采用H\-2O\-2-鲁米诺发光体系,探讨了反应时间、底物浓度、样品浓度、样品保存等因素对测定的影响,得到较好的线性和重复性.     

琉球病毒、索尔韦齐病毒、苏里斯病毒等三种沙粒病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究

建立可检测琉球病毒(Ryukyu virus,RYKV),索尔韦齐病毒(Solwezi virus,SOLV)以及苏里斯病毒(Souris virus,SOUV)等三种沙粒病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法.分析三种病毒流行病学分布特征,从国际公共数据库搜索下载基因组序列,进行比对分析,确定检测靶标,借助primer premier 6.0生物信息学软件,设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,利用化学合成和体外转录方法制备模拟样本,比较评价三种方法的检测限、特异性、重复性特征.所建实时荧光定量RT-PCR检测方法均可有效扩增检测病毒RNA靶标,检测限分别为40拷贝/μL、7拷贝/μL和15拷贝/μL,检测汉城病毒、汉滩病毒、登革病毒Ⅰ～Ⅳ型分离株、发热伴血小板减少综合病毒及30份健康人血清样本无非特异性扩增,三种病毒相互间以及其他8种出血热相关沙粒病毒RNA间无交叉反应,重复性比较分析显示变异系数均在2％以内.本研究建立的检测RYKV、SOLV和SOUV三种沙粒病毒的实时荧光RT-PCR方法具备用于相关疑似感染者临床样本、宿主动物标本以及进出口物品的筛查检测的潜力,但因未经基于实际病毒感染样本的比较评价,检测结果的解释仍具有一定的局限性.     

邻苯二甲酸酯类(PAEs)对三角鲂的急性毒性研究

为了研究邻苯二甲酸酯对水生态系统的危害,以三角鲂(Magalobrame Tarminalis)幼鱼为研究对象,探讨邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二-2-乙基己酯(DEHP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)4种PAEs化合物对其急性毒性效应。结果表明:以上4种化合物在暴露24 h、48 h和96 h的半致死质量浓度(LC50)分别为2.75、2.41和2.08 mg/L;5.29、4.12和3.29 mg/L;6.56、6.15和5.41 mg/L和6.98、6.84和6.60mg/L。其安全浓度(SC)分别为0.55、0.79、1.62和2.00 mg/L。三角鲂幼鱼对4种PAEs化合物的中毒症状相似,但4种物质的致死浓度区间存在差别,4种物质对三角鲂幼鱼的毒性大小顺序为DBP>DMP>DEHP>DEP,三角鲂幼鱼对4种PAEs化合物均表现出显著的时间效应和剂量效应,呈正相关。结果表明,4种物质在试验浓度下对三角鲂幼鱼产生了明显的毒性作用,对水生生物存在危害,应对其水生态风险加以关注。为制定4种PAEs水质标准及对其进行生态风险评价提供科学依据。     

龙眼胚性愈伤组织DlGRAS4与DlGRAS54基因的克隆及表达分析

以龙眼松散型胚性愈伤组织为实验材料,采用RT-PCR结合RACE法,克隆了植物特异转录调控因子DlGRAS4和DlGRAS54的cDNA全长序列和DNA序列,并进行生物信息学以及表达分析。结果表明:DlGRAS4全长1 668bp,开放阅读框(ORF)1 296bp,编码431个氨基酸(GenBank登录号:KC127683);DlGRAS54全长2 113bp,ORF 1 659bp,编码552个氨基酸(GenBank登录号:KC127684);DlGRAS54的DNA序列在5′-UTR含有1个1 533bp的内含子。生物信息学分析表明:DlGRAS4和GRAS54是不稳定亲水蛋白,不含信号肽,具有跨膜结构和GRAS家族的保守结构域,亚细胞定位于细胞膜中;与毛果杨、葡萄、蓖麻和可可等具有较高的同源性。系统进化树分析显示,DlGRAS54与拟南芥AtPAT1、葡萄VvPAT1、毛果杨PtPAT1、大豆GmPAT1处于同一分枝;DlGRAS4与拟南芥AtSCL23、玉米ZmSCL23处于同一分枝。推测DlGRAS4和DlGRAS54是GRAS基因家族的成员。qPCR结果表明,DlGRAS4在整个发育阶段转录水平呈"W"型变化趋势,在球形胚和子叶形胚阶段的表达量达最大值;DlGRAS54在整个发育阶段的转录水平呈"M"型变化趋势,在球形胚和鱼雷形胚阶段表达量达最大值,表明DlGRAS4和DlGRAS54主要在发育的中晚期起作用。外源赤霉素处理后DlGRAS4和DlGRAS54的表达量明显上调,说明DlGRAS4和DlGRAS54对赤霉素处理能做出积极的反应。     

龙眼胚性愈伤组织DRM1基因的克隆及其定位与表达分析

该研究以龙眼胚性愈伤组织的转录组数据为基础,对龙眼胚性愈伤组织DlDRM1基因进行克隆和生物学信息分析,并检测其在体胚发生过程中不同发育阶段、不同浓度的外源激素(2,4-D、IAA、KT)处理下及不同组织部位的表达,以揭示DlDRM1基因在龙眼体胚发生过程中的功能。结果表明:(1)从龙眼转录组unigene序列筛选获得龙眼结构域重排甲基化酶1基因(命名为DlDRM1)全长序列,并利用RT-PCR法从‘红核子’龙眼胚性愈伤组织中克隆获得DlDRM1基因的cDNA全长序列(GenBank登录号为KY990493);DlDRM1基因cDNA全长2 574bp,包括494bp的5′UTR,184bp的3′UTR,可编码包含631个氨基酸的蛋白质。(2)生物信息学分析显示,DlDRM1是一个不稳定的亲水蛋白,不含信号肽,不存在跨膜结构域,其分子式为C_(3104)H_(4839)N_(851)O_(984)S_(28);序列比对和系统进化分析表明,龙眼DlDRM1与脐橙DRM相似度最高(76.85%),二者亲缘关系也最为接近。(3)实时荧光定量PCR分析发现,DlDRM1在龙眼各组织器官中均有表达,且在果肉中表达量最高,其次是花蕾,在叶中的表达量最低;DlDRM1基因在非胚性愈伤组织中表达量最高,而且在非胚性愈伤向胚性愈伤转变过程中DlDRM1基因的表达量呈逐步下降趋势,说明DlDRM1基因与体胚胚性呈负相关关系,在龙眼体胚发生过程中可能发挥着重要的作用;一定浓度的IAA和2,4-D能够促进DlDRM1基因的表达,而KT则抑制DlDRM1的表达。(4)亚细胞定位结果表明,DlDRM1定位于细胞核和细胞膜上。