Inadvertent gene silencing of argininosuccinate synthase (bcass1) in Botrytis cinerea by the pLOB1 vector system

For several years, researchers working on the plant pathogen Botrytis cinerea and a number of other related fungi have routinely used the pLOB1 vector system, based on hygromycin resistance, under the control of the Aspergillus nidulans oliC promoter and what was reported to be the β‐tubulin (tubA) terminator. Recently, it has been demonstrated that this vector contains a 446‐bp portion of the B. cinerea argininosuccinate synthase gene (bcass1) rather than the tubA terminator. As argininosuccinate synthase is essential for the production of l ‐arginine, inadvertent gene silencing of bcass1 may result in partial l ‐arginine auxotrophy and, indeed, may lead to altered phenotypes in planta. In this article, we report our findings relating to possible problems arising from this incorrect plasmid construction. As an absolute baseline, gene disruption of bcass1 was carried out and generated a strict auxotroph, unable to grow without exogenous arginine supplementation. The knockout displayed an alteration in host range in planta, showing a reduction in pathogenicity on strawberries, French bean leaves and tomatoes, but maintained wild‐type growth on grape, which is in accordance with the reported arginine availability in such tissues. Deliberate gene silencing of bcass1 mirrored these effects, with strongly silenced lines showing reduced virulence. The degree of silencing as seen by partial auxotrophy was correlated with an observed reduction in virulence. We also showed that inadvertent silencing of bcass1 is possible when using the pLOB1 vector or derivatives thereof. Partial arginine auxotrophy and concomitant reductions in virulence were triggered in approximately 6% of transformants obtained when expressing enhanced green fluorescent protein, luciferase, monomeric red fluorescent protein or β‐glucuronidase using the pLOB1‐based expression system, which inadvertently contains 446 bp of the bcass1 coding sequence. We recommend the testing of transformants obtained using this vector system for arginine auxotrophy in order to provide assurance that any observed effects on the development or virulence are a result of the desired genetic alteration rather than accidental bcass1 silencing.     

大鼠主动脉内皮细胞的分离培养和鉴定

目的:探索大鼠主动脉原代内皮细胞体外培养方法,为体外研究提供细胞模型。方法:分离大鼠主动脉,直接贴壁于培养皿中,荧光倒置显微镜观察细胞形态,免疫组化Ⅷ因子相关抗原染色鉴定细胞。结果:约24小时组织块边缘有游离的新生细胞长出,7天即融合成片。消化传代后细胞呈短梭形或三角形,单层生长,铺路石状,Ⅷ因子表达阳性,呈指数增殖。冻存后复苏细胞活性均超过90%。结论:用贴壁法成功建立了大鼠血管内皮细胞体外培养方法,冻存细胞存活率高,为体外研究提供了稳定的模型。     

阻生牙拔除术的临床进展

阻生牙是指由于各种阻力导致不能正常萌出的牙齿的统称,通常阻生牙牙体大部甚至全部埋伏于骨内。阻生牙可导致各种并发症的发生,因此临床上一般主张预防性拔除阻生牙。阻生牙拔除手术因其难度高、风险大、术后反应重一直是口腔牙槽外科关注的重点。近年来随着手术器械、手术观念等方面的进步,阻生牙拔除术取得了一些临床进展。新型CT扫描设备CBCT可以为手术设计提供精确定位;借助各类微创器械,微创拔牙技术减小了手术创伤,降低了手术风险;新型麻醉方式和新型局麻药物可以极大减轻疼痛反应;心理干预也将成为阻生牙拔除患者围手术期管理的重要步骤。本文对近年来阻生牙拔除术在定位方式、微创技术、团队协作、疼痛控制和心理干预等方面的临床进展做一综述。     

SSB蛋白的高效表达及其与ssDNA的相互作用

大肠杆菌单链结合蛋白SSB在DNA复制、重组和修复中起着重要作用。为研究单链结合蛋白SSB的体外生物功能构建了融合蛋白SSB的表达载体并使其高效表达及易于纯化。ssb基因片段是以E.coli K-12基因组为模板经PCR扩增获得,并通过基因的体外拼接成功构建了表达载体pQE30-ssb。重组菌株M15/ pQE30-ssb经过IPTG的诱导表达了蛋白SSB。收集菌体细胞、超声波破碎后离心取上清进行SDS-PAGE分析,结果表明有一与预期分子量（20.6 kD）相应的诱导表达条带出现,其表达量约占全细胞蛋白的30％且以可溶形式存在。利用固定化金属离子（Ni2+）配体亲和层析柱纯化融合蛋白SSB,其纯度达到90％。通过凝胶层析和等离子共振技术对SSB的生物功能进行了系统研究分析。结果表明,SSB蛋白以四聚体形式与单链DNA分子结合,其亲和力常数（KD）为4.79×10-7 M。     

20世纪生物科学前进的足迹(Ⅱ)

1951年　　△阿尔农(Ａｒｎｏｎ)确认叶绿体可以产生氧气,合成ＡＴＰ,固定ＣＯ2等。△英国桑格(ＦｒｅｄｅｒｉｃｋＳａｎｇｅｒ)确定胰岛素的分子结构及氨基酸排列顺序。1952年△布里吉斯(Ｂｌｅｃｇｉｓ)研究细胞分化中核与细胞质的关系。△派拉德(Ｐａｒｄｅｅ)发现线粒体的构造是梳子状的。△法国外科医生和生物学家亨利拉博里(Ｈｅｎｒｙ.Ｌａｒｂｅｌｙ)首次使用氯丙嗪,从此揭开了精神病药理学的新纪元。△美国的盖茨(Ｇａｔｅｓ)合成吗啡。△美国的赫尔希(Ａ.Ｄ.Ｈｅｒｓｈｙ)和蔡斯(Ｍ.Ｃｈａｓｅ)实验证明脱氧核糖核酸(ＤＮＡ)是遗…     

[反]-β-法尼烯与氟取代物分子结构叠合差异分析

利用计算机辅助分子叠合法对蚜虫报警信息素［反］-β-法尼烯(EBF)的氟取代系列物与EBF的结构进行比较,初步研究了EBF及其氟取代系列物的结构 活性之间的关系。发现对于1氟、2氟及3氟的取代物来说,在分子骨架共轭双键端进行氟取代修饰,所得取代物结构与EBF最为近似,可能具有生物报警活性。     

菜豆环氧化物水解酶的表达及其催化特性研究

【背景】光学纯环氧化物及邻二醇是一类多功能手性砌块。与化学合成法相比,环氧化物水解酶(EHs)介导的生物转化法因环境友好而成为当前的研究热点。【目的】从菜豆(Phaseolus vulgaris)中克隆一种EH基因并进行原核表达,研究重组酶催化环氧苯乙烷(Styrene oxide,SO)的水解特性。【方法】通过计算机辅助分析EHs的一级结构,推测一种菜豆来源的未知功能蛋白(PvEH4)可能具有EH活性。利用RT-PCR技术,以菜豆总RNA为模板,扩增编码PvEH4的基因pveh4,并实现其在Escherichia coli BL21(DE3)中的表达。利用重组菌E.coli/pveh4全细胞催化SO水解,分析PvEH4的对映选择性和区域选择性。【结果】一级结构分析表明,PvEH4具有α/β折叠型EH特有的保守区域。SDS-PAGE结果显示PvEH4的表观分子量为39.4 kD。PvEH4针对SO的对映选择率(E值)为10.1,区域选择性系数αS和βR分别为99.5%和82.5%。当外消旋SO转化率达到68.1%时,可同时获得99.9%ees的(R)-SO和92.3%eep的(R)-苯乙二醇(Phenyl-1,2-ethanediol,PED),两者的产率分别为31.9%和65.6%。【结论】PvEH4的挖掘不仅增加了植物类EHs的数量,同时也为EHs的蛋白分子改造提供参考。     

蚜虫雄蚜与雌性母对性信息素及植物挥发物的田间反应

田间观察了桃蚜Myzus persicae (Sulzer)、绣线菊蚜Aphis spiraecola Patch 、山楂圆疣蚜Ovatus crataegarius (Walker)等3种蚜虫对性信息素[(4aS,7S,7aR)-荆芥内酯和 (1R,4aS,7S,7aR)-荆芥醇]的反应,并且调查了性信息素与植物挥发物对桃蚜的田间引诱活性的相互作用.在有冬寄主或夏寄主植物的田中,性信息素诱捕器诱捕到桃蚜雄蚜与雌性母的数量显著多于对照诱捕器的诱捕数;但在非寄主植物的田中,却引诱不到桃蚜.苯甲醛(冬寄主植物桃树Prunus persica的主要挥发物组分之一)能够增强桃蚜雄蚜的引诱作用.绣线菊蚜雄蚜和雌性母对植物中提取的荆芥内酯有反应,而山楂圆疣蚜雄蚜和雌性母对植物中提取的和人工合成的荆芥内酯都没有反应,但对荆芥醇有反应.并且在荆芥醇中添加荆芥内酯之后对山楂圆疣蚜雄蚜引诱活性显著提高.还讨论了雌性蚜产生化合物被雄蚜作为性信息素、被雌性母作为聚集信息素以及性信息素与寄主植物挥发物的相互作用.     

霍乱弧菌分型噬菌体VP3蛋白的双向电泳分析

目的:噬菌体-生物分型方案具有区分霍乱弧菌潜在致病力的作用,VP3是5个霍乱弧菌分型噬菌体之一。对VP3成熟颗粒的蛋白组成进行测定和分析,以补充基因组注释信息。方法:在全基因组测序及生物信息学分析的基础上,利用双向电泳技术及质谱鉴定,对纯化的成熟VP3噬菌体的结构蛋白进行分离及鉴定。结果:双向电泳分离得到近20个蛋白点,质谱鉴定出了其中的10个,对应于4个VP3蛋白和4个霍乱弧菌蛋白。结论:VP3结构蛋白的组成和T7具有很高的相似性。与噬菌体颗粒一起被纯化分离的宿主蛋白可能在VP3的转染过程中起作用。     

微生物酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究进展

D-对羟基苯甘氨酸(D-p-HPG)是半合成青霉素和头孢霉素的重要前体。综述了微生物酶法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法种类及其优缺点并对酶的来源即菌种的选育方法做了总结。此外,还简介了基因工程领域内的研究状况。