家蚕生存素基因在BmN4细胞有丝分裂中的功能分析

【目的】阐明生存素基因在家蚕Bombyx mori BmN4细胞有丝分裂中的功能。【方法】qRT PCR分析家蚕生存素基因BmSurvivin在家蚕5龄第3天幼虫不同组织(丝腺、中肠、马氏管、精巢、卵巢、脂肪体、皮细胞层和表皮)中的表达量;构建pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP (BG)融合载体并转染BmN4细胞,以免疫荧光标记检测BmSurvivin和第10位丝氨酸(Ser10)磷酸化的组蛋白H3(H3Ser10ph)在BmN4细胞有丝分裂分裂不同时期的定位。【结果】BmSurvivin在家蚕5龄第3天幼虫马氏管中表达量最高,其次是在丝腺和中肠中。成功构建pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP载体。免疫荧光结果显示,在BmN4细胞间期核中可以看到明显的GFP信号,涵盖了细胞核和细胞质区域,指示BmSurvivin的定位;随着细胞进入分裂期,GFP信号指示BmSurvivin与染色质共定位,待细胞形成明显的双取向时在纺锤体区域也可以看到GFP信号;后期随着姐妹染色单体分开,GFP信号指示BmSurvivin定位在染色质及胞质分裂区;末期随着两个新的子细胞形成GFP信号指示BmSurvivin仅定位在胞质分裂区。H3Ser10ph定位在BmN4细胞前中期染色质凝缩处,至中期信号最强,与整条染色体重合,后期信号消失。【结论】BmSurvivin与有丝分裂周期中染色质和纺锤体的动态变化相关。     

头孢菌素C乙酰化酶的半理性改造及7-ACA的生物合成

CPC乙酰化酶是一步酶法制备7-ACA的关键酶,针对它的研究具有重大的经济价值。为了获得对CPC具有更高催化活性的CPC乙酰化酶,以Pseudomonas sp SE 83来源的Ⅲ型CPC乙酰化酶CA Ⅲ为亲本,借助分子对接的手段确定了它与CPC结合的关键氨基酸残基,并确定将这些关键氨基酸残基突变为侧链基团更小的氨基酸残基,对CA Ⅲ的编码基因利用多点定点突变试剂盒完成定点突变后借助p ET32a质粒在E.coli BL21(DE3)中实现了可溶性表达,获得了对CPC催化活性更高的重组突变体reCA Ⅲ~M,其比酶活为26.7 IU/mg,较原酶提高了3.44倍。此外,初步研究了利用reCA Ⅲ~M进行一步酶法生产7-ACA的工艺,40 IU/g CPC的加酶量、25℃的条件下反应12 h,CPC的转化率和7-ACA的得率分别可达96.3%和63.4%,表明该酶具有良好的应用前景。CPC乙酰化酶的分子改造上取得的较为理想的结果,为该酶进一步的分子改造及应用奠定了坚实的基础,也为其它酶的分子改造提供了可资借鉴的经验。     

家蚕miR-2769靶基因的鉴定及表达分析

【目的】MiRNAs在昆虫变态发育过程中发挥非常重要的作用。对家蚕Bombyx mori miRNAs及靶基因的研究将有助于阐明miRNAs参与调控家蚕变态发育的分子机制。【方法】往家蚕5龄第2天幼虫血淋巴注射蜕皮激素20E后,qRT-PCR检测miR-2769在家蚕脂肪体中的表达;通过生物信息学方法预测家蚕miR-2769的靶基因;利用双荧光酶报告载体系统分析miR-2769与预测靶基因BmE75B的互作;qRT-PCR检测miR-2769及其靶基因BmE75不同剪接体在家蚕不同发育时期(幼虫、蛹和成虫)和幼虫不同组织(头、表皮、丝腺、脂肪体、精巢、卵巢、马氏管、中肠和血淋巴)中的表达量。【结果】研究结果表明,miR-2769可通过与家蚕BmE75B的3′UTR区结合位点的互作,显著抑制荧光素酶报告基因的表达。qRT-PCR结果表明,miR-2769和BmE75A/BmE75B在20E诱导家蚕脂肪体中表达趋势相反。时空表达分析结果表明,miR-2769与BmE75的不同剪接体在家蚕不同发育时期和不同组织中均具有特异性表达特征。在家蚕变态发育的不同阶段,miR-2769和BmE75A的表达量均较低,而BmE75B在蛹期表达量较高,BmE75C在5龄末幼虫和蛹早期有极高表达水平。此外,miR-2769与BmE75不同剪接体均存在一定程度的表达负相关。在家蚕5龄幼虫血淋巴中miR-2769可促进BmE75A的表达,在脂肪体中miR-2769可促进BmE75B的表达,而在其他组织中miR-2769抑制BmE75不同剪接体的表达。【结论】家蚕miR-2769可通过与BmE75B的3′UTR区的互作对BmE75不同剪接体的表达进行负调控。     

安全转基因技术研究进展

转基因生物安全性问题已引起了公众的普遍担忧,严重制约了转基因技术成果的推广应用。近年来,研究者探索了不同的技术策略来解决转基因生物的安全性问题,安全转基因技术成为当前转基因研究的热点之一。文章介绍并评价了几种主要的安全转基因技术,包括无选择性标记基因技术、安全标记基因技术、叶绿体转化技术、终止子技术、雄性不育技术、外源基因删除技术。其中,外源基因删除技术为实现转基因生物的安全应用展示了诱人的前景。最后,对探索新的安全转基因技术策略保障转基因生物安全提出了建议。     

2009-2011年北京通州区分离的副溶血性弧菌的耐药谱分析

目的：了解北京市通州区副溶血性弧菌的耐药情况,用以指导临床治疗用药及防控措施的制定。方法：选取通州区2009~2011年在食品监测和门诊病人中分离收集的60株副溶血性弧菌,采用微量肉汤稀释法,测定菌株对23种抗生素的最小抑菌浓度,并用碱裂解法和脉冲场凝胶电泳检测菌株的质粒谱,用PCR方法检测菌株中整合子及SXT元件的携带情况。结果：菌株对阿莫西林、氨苄西林、盘尼西林和多粘菌素等4种抗生素的敏感性低于40%,对妥布霉素有5%的中度耐药,对其余18种抗生素100%敏感;质粒携带率低,仅2株菌SXT整合酶阳性,Ⅰ、Ⅳ类整合子全部阴性。结论：北京市通州区副溶血性弧菌的耐药不严重,除2类抗生素外,其余抗生素在副溶血性弧菌感染的治疗中都有效。     

大鼠膝骨关节炎滑膜细胞原代培养

目的:建立原代培养膝骨关节炎大鼠滑膜细胞的方法。方法:取膝骨关节炎大鼠膝关节滑膜组织,用酶消化法消化、分离细胞,用DMEM培养液进行培养并传代,观察滑膜细胞生长状况、并用细胞形态学及细胞免疫化学鉴定。结果:用酶消化法培养膝骨关节炎滑膜细胞,方法简单、成功率高、细胞形态典型。结论:单一的胶原酶消化法是一种有效的滑膜细胞原代培养的方法,可以满足一般实验需求。     

聚天冬氨酸-甲硝唑纳米前药制备、表征及抗虫活性的初步研究

实验以聚天冬氨酸(PASP)为载体,以甲硝唑为模型药物,用较温和简便的方法制备了新型聚天冬氨酸-甲硝唑(PASP-MTI)纳米前药．采用红外光谱及核磁氢谱分析、透射电镜观察、激光粒度、透析和紫外分光光度测定、MTT比色、荧光显微镜和流式细胞术等方法,观察到甲硝唑以酯键方式键合于聚天冬氨酸高分子链上．PASP-MTI纳米前药呈球型,平均粒径404.8 nm,载药量30%,体外释药明显延缓;MTT结果显示,PASP-MTI显著提高甲硝唑对滴虫的抑杀作用,经纳米甲硝唑作用后,部分滴虫胞核出现染色质浓集、核固缩、核碎裂等一系列凋亡改变．流式细胞术检测可见凋亡峰,凋亡率由对照组的11.5%上升到纳米前药组的35.69%．上述实验结果表明：PASP是一种非常有潜力的前药载体,制得的新型PASP-MTI纳米前药具有载药量高、缓释和杀虫作用强等特点,可能的杀虫机制除与高聚物纳米前药促吞噬作用有关外,还与诱导滴虫凋亡有关．     

玉米AGO基因在籽粒发育过程中的表达分析

以玉米自交系‘昌7-2’授粉后4个时间点(授粉后7、10、14和20d)的籽粒总RNA为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术,对玉米中5个Argonaute(AGO)蛋白家族基因(AGO1、AGO2、AGO4、AGO10和AGO18)在籽粒不同发育时期的表达谱进行了研究。结果表明:AGO1和AGO2在籽粒发育过程中呈现一致的表达趋势,在授粉后7d的籽粒中表达量最高,从授粉后7d到20d呈持续下降的趋势。AGO4、AGO10和AGO18具有一致的表达趋势,均呈现先下降后上升的趋势,在授粉后10d的籽粒中表达量最低。结合实验室前期获得的miRNA在玉米籽粒不同发育阶段的表达谱,发现不同AGO家族基因可协助其靶标miRNA参与玉米籽粒发育调控。