沙门氏菌荧光实时定量PCR检测试剂的研制及应用

荧光实时定量PCR技术是近年来广泛应用于沙门氏菌快速检测的现代方法之一,本研究建立了检测沙门氏菌快速、敏感、特异以及准确定量的FQ-PCR方法。采用沙门氏菌fimY基因序列,设计特异引物和探针,通过对Taq酶、Mg2 和引物探针浓度等反应体系和条件的优化,然后进行特异性和适用性实验。最优化结果为:Taq酶用量2.5U;Mg2 浓度为3.75×10-3mol/L;引物浓度为0.65×10-6mol/L,探针浓度为0.30×10-6mol/L;循环条件为step1:95℃2min,step2:95℃5s,60℃40s,40cycles。结果表明该FQ-PCR检测试剂具有快速、简单、灵敏度高、特异性强和适用范围广等优点,可应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等领域。     

人α-半乳糖苷酶、α-1,2-岩藻糖转移酶cDNA序列转染克服异种移植超急性排斥反应

半乳糖α 1,3 半乳糖抗原是引起异种器官移植超急性排斥反应 (hyperacuterejection ,HAR)的主要抗原 .α 半乳糖苷酶和α 1,2 岩藻糖转移酶基因可以以不同的方式降低半乳糖α 1,3 半乳糖抗原在内皮细胞表面的表达量 .将人α 半乳糖苷酶基因和α 1,2 岩藻糖转移酶基因单独或连接在一起导入猪血管内皮细胞PEDSV .15中 ,检测细胞表面的抗原及异种天然抗体对细胞杀伤作用 .结果表明α 半乳糖苷酶基因可以将猪血管内皮细胞表面的半乳糖α 1,3 半乳糖抗原清除 74 13%,而α 1,2 岩藻糖转移酶基因也可以清除 4 7 75 %的细胞表面异种抗原 ,但二者都不能达到完全清除的目的 .当α 半乳糖苷酶和α 1,2 岩藻糖转移酶双基因在内皮细胞内共表达时 ,则可以基本清除半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 .抗原的减少也可以相应地减弱内皮细胞对异种天然抗体介导的杀伤作用的敏感性 ,尤其是双基因共表达时细胞基本不被杀伤 .结果表明 ,α 半乳糖苷酶基因和α 1,2 岩藻糖转移酶基因可以有效地清除血管内皮细胞表面的半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 ,克服HAR的发生 ,为下一步进行动物实验 ,探讨克服异种移植HAR提供了技术途径     

巴西蘑菇对木质纤维素的降解与转化*

巴西蘑菇能够降解棉籽壳和麦草两种培养基中木质纤维素复合体中的全部组分,属于白腐真菌;巴西蘑菇降解的有机物质的绝大部分被菌体的呼吸过程消耗掉,其绝对生物学效率较低,仅为4.41%~5.25%;在栽培前期木质素的降解速率大于纤维素和半纤维素,这对纤维素和半纤维素的降解十分有利;非木质纤维素组分主要在菌丝生长阶段被利用,而木质纤维素是子实体生长发育阶段的主要碳源;就整个栽培过程而言,巴西蘑菇生长发育所需要的82.39%~84.50%的碳源来自木质纤维素。     

家蚕蛹变态期丝腺组织的退化与细胞凋亡特征

利用形态学观察方法、分子生物学检测方法以及20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone)和放线菌酮(cycloheximide)体外培养方法, 研究了家蚕Bombyx mori 蛹变态期丝腺组织的退化与细胞凋亡特征。显微镜的观察显示家蚕丝腺的逐渐退化发生在吐丝期间。DNA梯度电泳的分析表明程序性细胞死亡(programmed cell death)可能伴随发生在丝腺的退化过程中。在离体培养条件下, 用20-羟基蜕皮酮处理5龄第6天幼虫的丝腺, 导致的细胞凋亡提前于对照, 提示在进入蛹变态期前, 20-羟基蜕皮酮提早激发了介导家蚕丝腺细胞凋亡与水解机制的遗传调控级联系统。上述结果表明, 20-羟基蜕皮酮能够诱导家蚕丝腺组织在蛹变态期发生程序性细胞死亡。     

阿霉素抗4T1乳腺癌荷瘤小鼠的免疫调控机制

为了探讨阿霉素 (Adriamycin,ADM) 对4T1乳腺癌荷瘤鼠BALB/c的免疫调节作用,采用定量蛋白质组学串联质量标签 (TMT) 标记技术检测ADM对4T1乳腺癌差异蛋白的影响,利用多重数据库对差异蛋白进行生物信息学分析。根据蛋白质组学结果,寻找差异蛋白中与免疫调节功能相关的靶点,通过酶联免疫吸附测定 (Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 观察ADM对乳腺癌组织中Th1细胞 (Helper T cells 1,Th1) 和Th2细胞 (Helper T cells 2,Th2) 的影响;通过流式细胞术分析ADM对CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和调节性T细胞 (Regulatory T cells,Tregs) 的影响;HE染色观察ADM对4T1乳腺癌荷瘤鼠胸腺的改变。ADM上调170种差异蛋白,下调58种差异蛋白。有73种差异蛋白与免疫调控过程相关,KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG) 富集于细胞因子及受体相关的重要蛋白通路、白介素17 (Interleukin 17,IL-17) 通路和癌症的转录调控通路。与免疫功能相关的差异蛋白与CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Tregs细胞的功能有关,而这些细胞的分型影响乳腺癌的预后。ADM极显著升高白介素2 (Interleukin 2,IL-2),CD4+ T细胞、CD8+ T淋巴细胞含量 (P<0.01),显著降低Tregs细胞含量 (P<0.05)。ADM抗乳腺癌的免疫调节蛋白有Ighm、Igkc、S100A8、S100A9和Tmsb4x。     

蚯蚓体内一种纤溶酶原激活剂(e-PA)的分离纯化

为获得一种高效,低廉的溶栓药物,从赤子爱胜蚓（Ｅｉｓｅｎｉａｆａｅｔｉｄａ）体内分离纯化出一种可体外激活纤溶酶原从而间接降解纤维蛋白的酶（ｅ－ＰＡ）．纯化过程包括：粗品的盐析,离子交换层析,凝胶过滤层析及疏水相互作用层析．该组份是由二个亚基通过疏水相互作用维系在一起的．通过凝胶过滤层析,可测得全酶的分子量为４５０００;ＳＤＳ电泳显示大、小亚基的分子量分别是２６０００与１８０００;而质谱法测得的大、小亚基的分子量分别为２４５５６．７与１５５４６．６．对大小亚基进行了氨基酸组成分析,结果显示大亚基不含Ｌｙｓ而小亚基不含Ｃｙｓ．测定了大亚基Ｎ端２５个氨基酸序列：ＶＩＧＧＴＮＡＳＰＧＥＩＰＷＱＬＳＱＱＲＱＳＧＳＷ．并与部分已知蛋白质序列进行了比较．ｅ－ＰＡ在纤维蛋白平板上表现有三种不同的纤溶活性     

毛竹根际可培养微生物种群多样性分析

[目的]为了了解天然毛竹林根际可培养微生物种群的多样性信息,[方法]采用稀释平板法,对浙江天目山和重庆缙云山天然毛竹林根际细菌和放线菌进行了分离,并对其16S rDNA序列进行了分析.[结果]分别从天目山和缙云山天然毛竹林根际分离得到51株和31株菌落形态差异的细菌和放线菌.16S rDNA序列分析表明,天目山和缙云山毛竹根际细菌主要包括厚壁菌门(Firmicutes,分别为40%和58%)、放线菌门(Actinobacteria,分别为36.7%和10.52%)、变形菌门-亚群(Alphaproteobacteria,分别为10%和5.26%)和变形菌门 --亚群(Gammaproteobacteria,分别为10%和26.32%),其中芽孢杆菌属(Bacillus sp.)为共同的优势菌属(分别为34.38%和42.11%).分离的菌株中,B188、B171和B152等6株与GenBank中已报道16S rRNA基因序列的相似性从90%到96%不等,可能代表着新属或种.[结论]这表明,天然毛竹林根际具有较为丰富的可培养微生物种群多样性,并存在一些潜在的新的微生物菌种资源.     

温室栽培光强和光质对高山红景天生物量和红景天甙含量的影响

为探讨光强及光质对高山红景天(Rhodiola sachalinensis)生物量和红景天甙含量的影响。于2000年4月至6月在东北林业大学温室内以移栽于大兴安岭加格达奇圃地人工种植生长3a的高山红景天为材料,通过纱布遮荫及遮以不同颜色的滤光膜分别进行了光强、光质控制实验(处理45d)。随着光强的降低,高山红景天全株生物量、根生物量、根的红景天甙含量和产量以及叶中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素的含量均有降低的趋势,但叶绿素含量变化很小,不同光强及对照之间的差异均未达到显著水平。相对光强为67．75％和44．71％的两种处理下的全株生物量、根生物量、根的红景天甙含量和产量差异不显著,它们的全株生物量和红景天甙含量与对照(全光照)的差异也不显著,但根生物量和红景天甙产量与对照的差异显著。当相对光强减弱至31．96％,全株生物量、根生物量、根的红景天甙含量和产量均大幅度下降,根冠比显著增加。4种滤光膜处理均使高山红景天的全株生物量及根生物量显著降低,蓝膜和绿膜处理的降低幅度大于红膜和黄膜处理的。红膜处理的红景天甙的含量和产量均高于对照,但黄膜、蓝膜和绿膜处理的红景天甙含量和产量则低于对照。通过计算去除4种滤光膜的光强因素,仅从光质的作用看。4种滤光膜处理仍是减小了全株生物量和根生物量,红膜和绿膜处理提高了红景天甙的含量和产量,而黄膜处理降低了红景天甙的含量和产量,蓝膜处理几乎没有效果。4种滤光膜处理均使叶绿素含量增加,但只有蓝膜处理的与对照差异显著。红膜处理不仅显著提高根中红景天甙的含量(为对照的3．42倍),而且对根生物量的影响较小(为对照的90．24％)。因而提高了高山红景天根的红景天甙产量,这意味着在生产上可能会有一定的实践意义。     

河静黑叶猴果实性食物组成、选择及其对种子的扩散作用

喀斯特森林的生态环境较其他类型的森林更为脆弱.由于抗干扰和恢复能力低,喀斯特森林中种子扩散对维持植物种群的续存与更新具极其重要的作用.叶猴以叶为主要食物,果实是仅列其后的第二大食物资源.对分布于喀斯特生境的叶猴来说,它们对果实的取食具有潜在的种子传播作用.基于此,于2009年7月-2010年12月,在越南广平的风芽-格邦国家自然公园,通过实地跟踪观察结合粪便收集调查了河静黑叶猴(Trachypithecus francoisi hatinhensis)对果实的选择及其对种子的潜在扩散作用.河静黑叶猴全年共采食果实类食物38科131种,取食的果实种类和取食高峰持续期均高于其他地区黑叶猴对果实的取食.这得益于当地原始雨林中丰富的果实食物资源.河静黑叶猴对果实种类没有明显的选择偏好(-0.3＜S112种果实＜0.3),果实资源的可获得性亦不影响其对果实的取食频次(r=-0.13,P=0.15＞0.05),在雨季的果实食物种类和取食强度上均高于旱季(z=-2.903,P=0.02＜0.05).在果实性状的选择上,河静黑叶猴对处理难度较小的浆果和核果(两种类型的果实共106种,占80.9％)有明显的选择偏好,更多地选择黄色(46种)、红色(29种)和绿色(14种)(三种颜色的果实占果实种类的68.7％),重量多为5 g以上较大的果实(共104种,占果实种类的79.4％),更多地选择果实内仅有1-2颗种子的果实.河静黑叶猴多吞食直径小于3 cm的种子,在猴群的粪便中发现了85种果实的种子,尤以肉质的浆果和核果最多,如垂叶榕(Ficus benjamina)、柿叶青梅(Vatica diospyroides)、构树(Broussonetia papyrifera)等.最远传播距离可达397 m.对其他的果实,则以吐出或丢弃的方式短距离传播,多集中在6-20 m范围.河静黑叶猴是一些果实较大或果皮较硬的植物重要的潜在扩散媒介,因为此类种子不能依靠鸟类吞食传播,如水浦桃(Syzygium jambos)、红毛丹(Nephelium lappaceum)和木奶果(Baccaurea ramiflora)等.河静黑叶猴一年中在雨季的夏秋两季(8-12月)对果实的取食强度达到高峰,这期间每月在猴群粪便中发现的种子数量均超过1000.结果反映出河静黑叶猴对喀斯特森林中的果实植物种子有潜在的传播作用.     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

以ILTV基因组为模板 ,利用PCR特异扩增出gB基因 ,定向克隆到中间质粒载体pY_α ,构建了中间质粒pY_α_gB。然后以中间质粒pY_α_gB为模板 ,扩增出含有人结核分枝杆菌启动子hsp70基因和堪萨斯分枝杆菌α信号肽基因的hsp_α_gB片段 ,回收补平后与穿梭表达载体pRR3平端连接 ,从而构建大肠杆菌_分枝杆菌穿梭表达质粒pR_α_gB。再将其电转化至耻垢分枝杆菌M .smegmatismc2 15 5 ,ELISA检测表明重组菌株M .smegmatismc2 15 5 (pR_α_gB)的表达产物具有很好的反应原性。Westernblot检测说明gB基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。鸡胚中和试验结果表明该重组菌株可以中和 1个剂量EID50 的ILTV强毒 ,能够保护SPF鸡胚抵抗强毒攻击