利用piggyBac转座子制备牛成体多能干细胞诱导技术研究

通过逆转录病毒等媒介表达核转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc可将体细胞重编程为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSc)。时至今日,已经报道了小鼠、人、大鼠、猪、羊、马、牛的iPS细胞,但大动物iPS的多能性特别是嵌合体形成和生殖细胞传代还没有得到确认。与逆转录病毒等不同的是,piggyBac转座子转染效率高且无病毒源性、操作简单,可以在转座酶的存在下被安全切除。首次尝试了采用piggyBac转座子携带鼠源Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Rarg和Lrh16个核转录因子诱导胎牛成纤维细胞,成功获得牛类iPS细胞,其形态与小鼠胚胎干细胞相似,克隆边界清晰、呈丘状、克隆内细胞致密、核大。RT-PCR与免疫组织化学染色分析均显示牛类iPS细胞表达多能性基因。该类细胞体外诱导分化可形成类胚体EB,且表达3个胚层的基因;体内诱导分化可形成畸胎瘤,苏木精、伊红染色显示瘤体有三胚层的分化。上述结果显示利用piggyBac转座子制备牛多潜能干细胞诱导技术可行,产生的牛类iPS细胞具有潜在多能性。     

单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备与鉴定

以单核细胞增生李斯特菌细胞碎片免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法成功筛选获得2株稳定分泌抗LM的单克隆杂交瘤细胞株4A7、4H11.抗体效价为1∶160 000以及1∶20 000,亚型为IgG1、IgG2a,Dot-ELISA结果表明4A7和4H11单克隆抗体具有很好的属特异性,Western blot分析表明4A7、4H11抗体分别与单核细胞增生李斯特菌62 kDa以及32 kDa外膜蛋白抗原表位结合,胶体金免疫电镜实验进一步确证以上抗体可有效识别单核细胞增生李斯特菌细胞表面抗原.     

局部应用依那西普治疗强直性脊柱炎髋关节受累的临床疗效分析

目的：评价局部应用依那西普治疗强直性脊柱炎髋关节受累的短期疗效。方法：选择我科2001-2011年收治的强直性脊柱炎髋关节受累的患者50例,在高频超声引导下于髋关节局部注射依那西普50mg,每周1次,连用4次。分别在注射前、注射后2、4、8周观察患者的BASDAI、BASFI、脊柱痛VAS、患者总体评价（PGA）VAS、夜间痛VAS、血沉、CRP和Harris功能评分,同时记录患者出现的不良反应。结果：依那西普治疗2周时,30例达ASAS20的缓解（60％）,13例（26％）达到ASAS50的缓解,8例（16％）达到ASAS70的缓解;治疗8周时,ASAS20／50／70的缓解率分别为38例（64％）、21例（42％）、15例（30％）,其中Harris评分达70以上者占总人数的90％,80分60％,90分30％,1例患者缓解不明显,4例患者处于70分以下,但疾病活动度情况改善。结论：依那西普可有效改善强直性脊柱炎髋关节受累患者的关节症状,降低疾病活动强度,且无明显药物不良反应。     

原生质体诱变选育高产异抗坏血酸菌株

以灰黄青霉菌(Penicillium griseofulvum HL)为出发菌株,试验得到灰黄青霉原生质体制备的优化条件为:菌体培养48h,用0.7mol/L的NaC1溶液作为渗透压稳定剂,用0.5％的蜗牛酶+0.5％的纤维素酶,在pH为6,30℃条件下酶解3h,所得原生质体数最多,达到3.14×107/ml.原生质体再生的最佳条件为采用双层平板培养法,在用0.7mol/L的蔗糖溶液配制的改进察氏培养基上其再生率最高,达到24.93％.灰黄青霉原生质体经过紫外线诱变,DES诱变,紫外线-DES诱变复合诱变,紫外线-氯化锂复合诱变选育异抗坏血酸高产菌株,通过对再生平板上长出的诱变菌株进行初筛和摇瓶复筛,最终获得一株异抗坏血酸产量较高的菌株ZD4,其产量为5.28mg/ml,提高到出发菌株产量(1.08 mg/ml)的488.9％,且连续传代6代遗传稳定.     

重组人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测

目的:利用基因工程方法构建人源性脂联素球状结构(gAd)基因的高效原核表达体系,并对重组蛋白进行诱导表达、纯化、鉴定及活性检测.方法:从正常人脂肪组织里面提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒pET-22b(+)-gAd,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.经诱导剂诱导后目的蛋白以包涵体形式产生,采用强碱促溶包涵体并用丙酮沉淀蛋白的方法进行复性和纯化,得到高纯度的人源性gAd.运用SDS-PAGE、Western blotting对重组蛋白进行鉴定,通过对蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用来检测纯化蛋白的生物学活性.结果:成功构建了原核表达载体pET-22b(+)-gAd,实现了人源性gAd在原核细胞中的表达,并对形成的包涵体变性、复性和纯化,纯化出的蛋白经过SDS-PAGE和Western分析证实为gAd;通过对AMPK的磷酸化水平的检测和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用证明纯化出的gAd具有高生物学活性.结论:成功构建、表达和纯化了无标签、高生物学活性的人源性脂联素球状结构(gAd),为其进一步的理论研究、生产开发奠定了基础.     

金属烤瓷全冠修复老年人活髓隐裂牙适应证及临床疗效

目的：探讨老年人活髓隐裂牙应用金属烤瓷全冠修复临床效果及适应症。方法：选取本院2006年1月至2011年1月期间收治的356例老年活髓隐裂牙合计621颗为研究对象,根据患牙疼痛程度随机将患者分为咬合疼痛组（A组）104例合计215颗患牙,咬合伴过敏性冷热刺激痛组（B组）122例合计232颗患牙,咬合伴延续性冷热刺激疼痛组（C组）130例合计174颗患牙,所有患者均接受金属烤瓷全冠修复,观察患者在治疗后1个月、6个月、12个月、18个月、24个月治愈情况以及牙髓及根尖周病变及牙髓发生情况。结果：与C组相比,A组、B组术后1个月、6个月、12个月、18个月、24个月治愈率以及总有效率较高,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：金属烤瓷全冠修复适合于轻微咬合疼痛以及咬合伴过敏性冷热刺激痛的患者,而对于咬舍伴延续性冷热刺激疼痛的患者则宜先行根管治疗术再进行全冠修复。     

胆管结石合并胆管癌的临床特征与诊治分析

目的：探讨胆管结石合并胆管癌的临床特征及诊治方法。方法：回顾性分析2000年1月-2009年12月我院收治的胆管结石合并胆管癌16例患者的临床病理资料。结果：胆管癌的发生率占同期胆管结石患者的3.1%,其临床表现以右上腹疼痛及反复的胆管炎发作为主,但缺乏特异性。术前胆管癌组患者AKP、γ-GT均有不同程度升高,ALT升高12例,总胆红素升高9例,与非胆管癌组相比,AKP、γ-GT、ALT、TBIL均显著升高（P〈0.01）,且胆管癌组术前血清CA19-9及CEA显著高于非胆管癌组（P〈0.01）,而两组间CA125及AFP水平比较无显著差异（P〉0.05）。16例患者中可进行手术治疗10例;其中根治性手术8例,姑息性手术2例。8例根治性手术患者的1、3年生存率分别为78.6%和36.4%;2例姑息性手术患者1、3年生存率分别为50.0%和0%,两组比较具有显著性差异（P〈0.05）。结论：胆管结石合并胆管癌的临床表现缺乏特异性,患者的疗效较差,对血清CA19-9和CEA显著升高者应行病理活检确诊,治疗手段应该力争实行根治性切除,有助于提高患者的生存期。     

卡介苗作用大鼠膀胱肿瘤细胞／正常移行上皮细胞后TNF—α．、IL-10、IFN-γ的检测及意义

目的：观察卡介苗（BCG）单独作用膀胱肿瘤细胞、正常膀胱移行上皮细胞及其代谢产物作用上述细胞后细胞生长情况及各自细胞培养液上清液中细胞因子（TNF-α．、IL-10、IFN-γ）浓度的变化,探讨其在卡介苗治疗膀胱肿瘤中可能的作用机制。方法：构建大鼠膀胱肿瘤模型,并原代培养大鼠膀胱肿瘤细胞及正常膀胱移行上皮细胞。分别用BCG,普通培养液和细胞培养的代谢产物作用上述细胞。酶联接免疫吸附剂测定法（ELISA法）检测各组细胞上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-10（IL-10）、干扰素-γ（IFN-γ）的浓度。结果：ELISA法检测各组细胞上清液中TNF-α、IL-10的浓度改变有显著差异,而IFN-γ的浓度无显著差异。结论：BCG可以直接刺激肿瘤细胞自身分泌细胞因子（TNF-α、IL-10）参与调节抑制肿瘤细胞的生长。     

南黄海沉积物中的丝孢菌初报

从南黄海采集沉积物样品19份,共分离到74个丝孢菌分离物。除22个青霉属菌株未鉴定至种外,其余经鉴定属于18属20种。其中包括1个中国新记录属Devriesia;2个中国新记录种Devriesia pseudoamericana、Scedosporium dehoogii;其余18种为中国已知种。对中国新记录属种进行形态学描述和基于ITS序列的分子生物学分析,对18个国内已报道种则只作分布和生境的引证。所有菌种均保存在中国海洋大学海洋生物标本室(OUCMB)。     

Role of Tomato Lipoxygenase D in Wound-Induced Jasmonate Biosynthesis and Plant Immunity to Insect Herbivores

In response to insect attack and mechanical wounding, plants activate the expression of genes involved in various defense-related processes. A fascinating feature of these inducible defenses is their occurrence both locally at the wounding site and systemically in undamaged leaves throughout the plant. Wound-inducible proteinase inhibitors (PIs) in tomato (Solanum lycopersicum) provide an attractive model to understand the signal transduction events leading from localized injury to the systemic expression of defense-related genes. Among the identified intercellular molecules in regulating systemic wound response of tomato are the peptide signal systemin and the oxylipin signal jasmonic acid (JA). The systemin/JA signaling pathway provides a unique opportunity to investigate, in a single experimental system, the mechanism by which peptide and oxylipin signals interact to coordinate plant systemic immunity. Here we describe the characterization of the tomato suppressor of prosystemin-mediated responses8 (spr8) mutant, which was isolated as a suppressor of (pro)systemin-mediated signaling. spr8 plants exhibit a series of JA-dependent immune deficiencies, including the inability to express wound-responsive genes, abnormal development of glandular trichomes, and severely compromised resistance to cotton bollworm (Helicoverpa armigera) and Botrytis cinerea. Map-based cloning studies demonstrate that the spr8 mutant phenotype results from a point mutation in the catalytic domain of TomLoxD, a chloroplast-localized lipoxygenase involved in JA biosynthesis. We present evidence that overexpression of TomLoxD leads to elevated wound-induced JA biosynthesis, increased expression of wound-responsive genes and, therefore, enhanced resistance to insect herbivory attack and necrotrophic pathogen infection. These results indicate that TomLoxD is involved in wound-induced JA biosynthesis and highlight the application potential of this gene for crop protection against insects and pathogens.