猪圆环病毒2型流行株的分离及其感染性克隆的构建

【目的】通过分离一株猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株,并构建其感染性克隆,为研究PCV2基因功能提供操作平台。【方法】通过PCR方法,从疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的仔猪淋巴结中鉴定为猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)2型阳性。把阳性病料接种PK-15细胞传代培养,在培养物中扩增出PCV2的全基因序列。对扩增出的全序列进行序列测定,并与GenBank中公布的5株广东PCV2分离株(GD-pz、GD-gj、GD-jm、GD-ss和GD-sz)进行同源性分析。通过EcoRⅠ和SalⅠ将PCV2全基因组序列克隆进pUC18载体中,获得含PCV2 GD-zq株全基因组单拷贝的重组质粒pPCV2-GD-zq,再通过SalⅠ和HindⅢ把另一个全长拷贝克隆进pPCV2-GD-zq质粒中,使PCV2 GD-zq株基因组DNA以头尾相接的双重复方式克隆进pUC18载体中,获得重组质粒pPCV2-2GD-zq。将pPCV2-2GD-zq DNA纯化和定量后转染PK-15细胞,拯救PCV2 GD-zq病毒。【结果】从PMWS感染的猪淋巴结中分离到了一株PCV2,命名为GD-zq株;序列分析结果显示,GD-zq株全基因组为1 767 bp,与GenBank中公布的5株广东PCV2分离株ORF1核苷酸一致性为97.1%-99.7%,编码氨基酸一致性为98.7%-100%;ORF2核苷酸一致性为93.2%-99.6%,编码氨基酸一致性为92.3%-99.1%;全基因一致性为96.0%-99.6%。pPCV2-2GD-zq质粒转染PK-15细胞后,其通过间接免疫荧光实验(IFA)能从转染细胞及其传代细胞中,检测到拯救出的病毒。【结论】分离了一株PCV2广东株GD-zq,成功构建了PCV2 GD-zq株的感染性克隆。     

高温和干旱胁迫对西红柿幼苗生长、养分含量及元素利用效率的影响

全球气候变化将增加未来高温与干旱的发生频率和强度,然而高温与干旱的交互作用对农作物生长、养分含量及其利用效率的影响还不甚清楚。因此,研究高温与干旱交互作用对农作物生理生态的影响将为准确评价农作物对未来极端气候条件的响应提供科学依据。选取全球第四大经济作物——西红柿为研究对象,在人工智能气候箱中模拟高温和干旱环境。共设置两个水分处理(正常浇水;干旱)与两个温度处理(常温-26℃/19℃(白天/夜间);高温-42℃/35℃(白天/夜间)(7d))。主要测定指标包括生物量以及生物量分配、比叶面积、养分含量(全氮、全磷)、光合元素利用效率(光合氮素利用效率、光合磷素利用效率)。研究表明,高温、干旱单独作用以及交互作用均显著降低了根、茎、叶生物量以及总生物量,并且高温干旱交互作用使总生物量降低最多。在生物量分配方面,高温单独作用显著降低了根质量分数以及根冠比,而干旱单独作用增加了根质量分数、茎质量分数以及根冠比,但降低了叶质量分数。在养分含量方面,高温单独作用导致叶片全氮、全磷含量显著降低、茎全磷含量显著增加、根全磷含量显著降低。干旱单独作用导致叶片、茎全磷含量显著降低、根全氮含量显著升高。高温与干旱交互作用对生物量分配及养分含量的影响与干旱胁迫单独作用类似。在光合元素利用效率方面,高温、干旱单独作用均降低了幼苗光合氮素利用效率、光合磷素利用效率,并且高温加剧了干旱对光合磷素利用效率的影响。因此,在未来气候变化情况下,高温与干旱交互作用可能会对农作物产生更大威胁。     

分子生物学技术在肠道菌群研究中的进展

人的肠道中栖息着大量微生物,这些微生物与宿主形成一个相互依赖且相互制约的微生态系统。肠道菌群结构与遗传、饮食、疾病、环境等因素存在千丝万缕的联系,其地位与作用相当于一个后天获得的"器官",对人体的消化、营养吸收、能量供应、脂肪代谢、免疫调节、抗病等诸多方面有不可替代的作用,因此,研究人的肠道菌群具有十分重要的意义和作用。本综述着重论述荧光原位杂交(FISH)、基于聚合酶链式反应的变性梯度凝胶电泳(Polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术、实时荧光定量PCR(Real-time polymerase chain reaction)技术、基因芯片(Gene chip)技术及以焦磷酸测序平台为代表的第二代测序技术等多种分子生物学技术在肠道菌群研究方面的应用,并对未来肠道菌群方面的研究进行展望。     

广西弄岗黑叶猴栖息地选择与利用

2005年9月至2006年8月对广西弄岗国家自然保护区内一群黑叶猴进行行为观察,采用瞬时扫描法观察并收集猴群的栖息地利用数据,分析黑叶猴对喀斯特石山栖息地的选择与利用规律。结果表明,黑叶猴对不同山体部位的利用有显著性差异(χ~2=43.063,df=4,P0.001)。黑叶猴对崖壁的利用频率最高(占总记录的36.67%±9.44%),其次是山坡(32.30%±9.57%),对山脚(14.15%±5.01%)、山顶(11.24%±8.42%)和平地(5.63%±2.92%)的利用较少。分析发现,黑叶猴对山体部位的利用没有显著的季节性差异(山顶:Z=-0.160,P=0.837;崖壁:Z=-0.320,P=0.749;山坡:Z=-0.480,P=0.631;山脚:Z=-1.601,P=0.109;平地:Z=0,P=1)。黑叶猴将崖壁作为主要的休息场所,山坡和山脚为主要的移动和觅食场所。黑叶猴对栖息地的利用受食物可获得性的影响。当食物中花的可获得性降低时,猴群增加对山脚的利用;当嫩叶可获得性降低时,猴群增加在崖壁移动的频率;当果实的可获得性升高时,猴群增加在平地觅食的频率。食物组成与黑叶猴栖息地利用也有关系。总体来看,黑叶猴对山顶的利用频率与花的觅食比例呈显著正相关;对山脚的利用频率与果实+种子的觅食比例呈显著正相关。猴群在山顶休息的频率随花和成熟叶的觅食比例的上升而上升;在山脚休息的频率随果实+种子的觅食比例的上升而上升。猴群在山坡觅食的频率随果实+种子的觅食比例的下降而上升;在山脚觅食的频率随嫩叶的觅食比例的下降而上升。另外,平均最低温度与猴群在平地觅食的频率呈负相关关系。分析表明食物的分布和数量对黑叶猴栖息地利用有重要影响,黑叶猴对栖息地的选择是在觅食利益与风险之间进行权衡的结果。     

皮氏菊头蝠(Rhinolophus pearsoni)的栖息生态特征

皮氏菊头蝠(Rhinolophus pearsoni)是我国南方典型的洞栖食虫性蝙蝠,具有重要的生态意义。近年于湘西州及张家界市的25个溶洞中共记录到该蝠450只次,对其栖息生态特征(空间分布、姿势、体温、栖点温度和栖点安全性等)进行了较为系统的观测。结果表明:该蝠的栖点主要集中分布于离洞口440 m之内的洞段(占99.3%),栖点高度通常介于2—10 m之间(84%),主要采取双足倒挂的姿势栖息于洞顶壁或侧壁,但单足倒挂的栖息姿势也较为常见(36.2%)。体温介于10.7—25.2℃,体温总是稍高于栖点温度,但两者之间无显著性差异(P0.05),且两者呈线性正相关。约64%的栖点"安全性高",而"安全性低"和"安全性中"的栖点分别占17.6%和18.4%。减少对洞穴的人为干扰是保护该物种的有效途径。     

深圳市福田区三维城市景观格局变化特征

城市景观是景观变化最快的类型之一,建成景观与绿地景观格局和功能的相互影响及空间配置是城市景观优化的核心。在紧凑型城市快速发展过程中,城市垂直方向增长成为主要扩展方式。如何定量分析三维城市景观格局变化,为城市景观优化提供科学依据还有待深入。选取深圳市福田区,以高分辨率遥感数据和建筑普查数据为基础,运用景观格局指数和景观连通性等方法定量分析建筑景观和绿地景观变化及空间影响。研究结果表明:(1)2003—2016年,福田区建筑景观主要表现为垂直向的立体扩展模式,新增建筑主要为高层和超高层建筑,建筑平均高度增加6.53 m,立体空间体积增加135.58×10~6 m~3,建筑密度仅增加2.42%,建筑景观高度差异逐渐增大,呈现出明显的三维空间异质性。(2)2003—2016年,建筑景观格局由"阶梯式"转变为"金字塔"形,受益于建筑景观的垂向增长,建成景观与绿地景观比例由1.20∶1调整为0.99∶1,建成景观减少4.03 km~2,绿地景观增加2.80 km~2。(3)建成景观的三维立体化释放了绿地景观用地空间,同时也限制了绿地景观的外部连通性,绿地景观连通性较低,大型绿地斑块间缺乏廊道连通,呈现孤岛化。研究可为城市景观空间优化和国土规划等实践提供科学依据。     

海岛植物不同演替阶段植物功能性状与环境因子的变化规律

植物功能性状与环境之间的关系是功能性状研究的重点,环境因子驱使植物功能性状发生变化,进而推动群落发生演替。以平潭岛4个不同演替阶段的森林植被(灌草丛、针叶林、针阔混交林、常绿阔叶林)为研究对象,结合不同群落演替阶段的物种特征和群落结构,分析海岛不同演替阶段茎、叶功能性状的变化规律,以及功能性状与环境因子的关系。结果表明:(1)随着演替的进行,土壤养分和水分逐渐增加,土壤pH逐渐下降。比叶面积(SLA)、叶片氮含量(LNC)、叶片磷含量(LPC)、茎氮含量(SNC)、茎磷含量(SPC)下降后上升,叶厚度(LT)、叶片碳含量(LCC)、茎碳含量(SCC)与之相反,叶干物质含量(LDMC)、茎组织密度(STD)逐渐上升。(2)冗余分析表明,演替早期植物主要分布在土壤pH、容重高的贫瘠环境,拥有较高SLA、SNC、SPC、LPC的性状组合;演替后期植物主要分布在土壤养分和水分高的肥沃环境,拥有较高的STD、LDMC、LCC、LNC的性状组合。其中,土壤有机质和全氮含量是影响海岛植物演替过程中功能性状变化的关键环境因子。研究海岛植物功能性状与环境之间的关系随演替的变化规律,探讨各演替阶段功能性状和环境特征,以及功能性状如何响应环境变化。旨在为今后选择合适的树种进行海岛植被修复和重建提供依据。     

大豆过氧化物酶在毕赤酵母中功能表达

【目的】大豆过氧化物酶(SBP)作用底物广泛、比活高、热稳定性好,使其在免疫检测、工业污染废水处理领域有着广泛的应用潜力。现有的生产方法主要是从大豆壳中提取,这种方法产量低,成本高,远不能满足于工业应用要求,本研究希望实现在毕赤酵母中高效表达有功能活性的大豆过氧化物酶。【方法】将大豆过氧化物酶基因以及C末端截短20个氨基酸的基因克隆pPIC-9K载体中,并在毕赤酵母X-33中诱导表达。同时还将糖基化位点的天冬酰胺突变成为谷氨酰胺,研究糖基化位点对表达的影响。【结果】全长SBP在毕赤酵母中表达是无活性的,只有截短的SBP△20在试管发酵的表达活力达23.5 U/mL,经过糖基化位点的突变表明130、144、185、197对酶活非常重要,不能突变;211和216位点去糖基化突变对酶活有所提高。【结论】经过发酵条件的优化,在5 L的发酵罐中发酵液上清最高酶活力达510 U/mL,是目前报道的最高水平。     

宁夏枸杞内生细菌的多样性及其抑菌活性研究

【目的】对宁夏枸杞各药用部位内生细菌的分布特征、遗传多样性和抑菌活性进行分析。【方法】采用菌落计数和16S rRNA基因序列分析法研究枸杞内生细菌的分布特征、遗传多样性,采用琼脂扩散法测定其抑菌活性。【结果】从各药用组织器官中分离出内生细菌34株,隶属于7科11属,内生细菌的数量和群落组成存在明显的组织特异性,其数量表现为根皮>叶>花>果实,而多样性则表现为花>根皮>叶>果实。芽孢杆菌属为枸杞优势内生菌群,分布于所有组织中;抑菌实验结果表明有76.5%的内生菌对一种或多种病原菌的生长有抑制作用,芽孢杆菌属菌株R2、R7、L3和短波单胞菌属的R3拮抗番茄炭疽杆菌和玉米大斑病菌的能力较强,而多数菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力较弱。【结论】枸杞可培养内生细菌遗传多样性丰富,对植物病原菌有较强的抑制活性。     

鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶的基因克隆、表达及最适反应pH改造

【目的】表达鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶(AvPAL),并经分子改造降低其最适反应pH。【方法】PCR克隆AvPAL编码基因,并在大肠杆菌中表达,用Ni2+亲和层析柱和凝胶柱纯化重组蛋白。利用GETAREA软件筛选与催化残基距离较近的暴露于酶分子表面的氨基酸位点,将其突变为带电性质不同的氨基酸,并对突变体进行酶学性质研究。【结果】在大肠杆菌中成功表达了AvPAL,纯化后得到电泳纯的重组酶。突变体E75Q和E75R的最适反应pH从8.5分别偏移到7.5和7.0。E75Q在pH 7.5时的比酶活较原酶提高了25%,在pH 6.5–9.5之间酶的稳定性良好,其最适反应温度为50 °C,在此温度下保温1 h酶活无显著变化。在最适反应条件下,E75Q的kcat/Km值较原酶提高了26.6%。【结论】改变AvPAL酶分子中起路易斯碱作用的关键氨基酸残基(质子受体)附近与之有相互作用的氨基酸的带电性质,降低了AvPAL的最适反应pH,提升了其在医疗领域的应用前景。