一株猪源化脓隐秘杆菌的鉴定、生物学特性研究与基因组分析

[背景] 化脓隐秘杆菌作为一种条件致病菌,常与蓝耳病病毒、猪圆环病病毒、巴氏杆菌等混合感染猪,引起各种非特异性化脓性感染,部分临床症状与副猪嗜血杆菌相似。本试验从江西某猪场一起因呼吸道症状急性死亡病猪的肺脏分离到一株具有β溶血特性、疑似化脓隐秘杆菌的细菌病原。[目的] 鉴定该病原的菌属种类、生物学特性及基因组特征,为该菌疾病的基础研究与临床防控奠定理论基础。[方法] 采用透射电镜、扫描电镜结合PCR鉴定等方法对菌属种类进行鉴定;通过动物实验、药敏试验,分析菌株的生物学特性;借助全基因组测序、生物信息学等技术发掘该菌的基因组特征。[结果] 形态观察、16S rRNA基因鉴定及系统发育分析证实,该分离菌株是化脓隐秘杆菌,命名为JX18;药敏试验表明,该菌株对克林霉素和林可霉素不敏感,对其余所选药物均敏感;动物实验结果显示,对小鼠腹腔攻毒后,小鼠腹部出现明显脓肿病灶,最高剂量组的小鼠全部死亡;全基因组测序结果表明,该菌株携带plo、nanH、nanP、fimA、fimC、fimE等重要毒力基因,并且与其他化脓隐秘杆菌菌株毒力基因的相似性较高;根据同源基因数据库（Cluster of Orthologous Groups,COG）预测,菌株JX18中参与碳水化合物代谢的基因占比最高;通过毒力基因数据库（virulence factor database,VFDB）、UniProtKB/Swiss-Prot等数据库预测,JX18菌株基因组中携带有多个组氨酸激酶、反应调节因子等与细菌双组分调控系统相关基因,以及多种与粘附、侵入及分泌系统相关的毒力基因。[结论] 在江西省分离鉴定出一株猪源强致病性化脓隐秘杆菌,丰富了猪源化脓隐秘杆菌病原信息,为进一步开展猪源化脓隐秘杆菌相关研究与防控奠定了理论依据。     

亚致死剂量吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂工蜂嗅觉学习行为的影响及其脑部转录组分析

【目的】分析吡虫啉处理对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica嗅觉学习行为及脑部基因转录的影响,为新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的负面影响提供依据。【方法】实验室条件下一次性饲喂意大利蜜蜂成年工蜂含有4 ng吡虫啉的50%蔗糖溶液,以饲喂不含吡虫啉的50%蔗糖溶液为对照,通过伸吻反应(proboscis extension response, PER)行为实验测定其对意大利蜜蜂成年工蜂嗅觉学习行为的影响;收集上述测试的意大利蜜蜂工蜂脑部提取RNA,进行RNA-Seq测序和生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR挑选6个差异表达基因(DEGs)检测其在脑部的表达量以验证RNA-Seq测序结果。【结果】一次性饲喂意大利蜜蜂成年工蜂含4 ng吡虫啉的50%蔗糖溶液后,意大利蜜蜂的嗅觉学习能力与对照组(饲喂50%蔗糖溶液)相比显著降低。RNA-Seq测序结果显示饲喂意大利蜜蜂含4 ng吡虫啉蔗糖溶液后,处理组与对照组之间共有123个DEGs［校正后的P值(padj)<0.05)］,包括82个下调DEGs和41个上调DEGs。GO聚类分析发现下调DEGs主要富集在S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶活性、酸性磷酸酶活性、氧化还原酶活性、蛋白质异二聚化活性等,上调DEGs主要富集在跨膜受体活性、分子传感器活性、神经学系统过程等功能条目。KEGG富集分析显示下调DEGs主要富集在核糖体和溶酶体等细胞器、碳代谢和色氨酸代谢等代谢通路及Toll和Imd信号通路,上调DEGs未富集在KEGG代谢通路。荧光定量PCR结果显示测试的6个DEGs相对表达量变化趋势与RNA-Seq测序结果FPKM(fragments per kilobase million)值变化趋势一致,证明RNA-Seq测序结果可靠。【结论】亚致死剂量吡虫啉胁迫意大利蜜蜂成年工蜂显著降低意大利蜜蜂的嗅觉学习能力,影响意大利蜜蜂脑部免疫解毒等相关基因的表达和酶活性及氧化还原等生物代谢过程;亚致死剂量吡虫啉短时胁迫会刺激意大利蜜蜂的嗅觉感觉过程及神经信号传导过程。     

基于多源数据的黄土高原陆地水循环结构变化分析

近几十年间,黄土高原的水循环进程在人类活动与气候变化的影响下已产生了剧烈的变化。为加深对水循环结构变化的了解与认识,利用1982-2010年的降水、蒸散发、径流、土壤储水量和社会经济用水等数据,运用Mann-Kendall趋势检验和线性回归分析方法,对黄土高原的水量平衡进行评估,且细化了组成水循环的12种水文变量,并分析了水循环各分量的变化趋势及其结构的演化规律。由于网格化的社会经济用水数据（1982-2010年）对本研究产生了较大的时间限制,因此本文注重于探究这29年间黄土高原各水文变量的变化趋势及水循环结构的演化规律。结果表明：在自然系统中,蒸散发以1.97 mm/a的速率上升（P<0.01）,径流、降水和土壤储水量分别以1.01 mm/a（P<0.01）、0.77 mm/a和0.46 mm/a的速率下降。在社会系统中,社会经济用水以0.50 mm/a的速率上升,其中主要由于生活、制造业、发电和采矿用水分别以0.22、0.23、0.30 mm/a和0.01 mm/a的速率增加所导致。此外,灌溉和牲畜用水分别以0.25 mm/a（P<0.05）、0.01 mm/a（P<0.01）的速率减少。就水循环结构而言,多年平均蒸散发和社会经济用水占水循环的平均比例分别为80.95%、15.27%,并以每年0.16%、0.06%的速率逐渐升高。径流、土壤储水量的变化占水循环的平均比例分别为4.00%、-0.24%,并以每年0.24%（P<0.01）、0.02%的速率逐渐下降。随着社会经济的发展和人口的增加,区域水资源供需矛盾将进一步加剧,本研究对黄土高原水资源的科学调控与可持续利用有重要参考意义。     

1株人乳头瘤病毒6型山东地方株的全基因组序列分析

人乳头瘤病毒6型(Human papillomavirus type 6,HPV6)是引起生殖器疣与复发性喉乳头瘤的主要病原体之一.为明确2019年济南市1例尖锐湿疣患者的病毒基因组序列特征,本研究提取其尖锐湿疣组织标本总DNA,分两段进行HPV6全基因组PCR扩增和步移法Sanger测序,将拼接后的序列与全球36条不同来源的HPV6全基因组序列进行对比分析.结果 显示,1013/19/JN/CHN/HPV6株(以下简称1013/HPV6)基因组全长8031bp,属于变异谱系B1,与全球不同地区HPV6分离株序列的同源性为98.4％～99.9％.1013/HPV6株与B1亚谱系参考株AF092932全基因组序列相比具有19个核苷酸变异位点,分布在7个开放阅读框架(Open Reading Frames,ORFs)和非编码区内.本研究首次分析了分离自中国大陆的HPV6全基因序列特征,研究结果为HPV分子进化的进一步研究和分型诊断试剂的优化提供了数据.     

江西省2010年柯萨奇病毒A组24型变异株的全基因组序列分析

急性出血性结膜炎(Acute hemorrhagic conjunctivitis,AHC)是目前人类最常见的眼病之一,柯萨奇病毒A组24型变异株(Coxsackievirus A24 variant,CV-A24v)是近年来报道引起该病的主要病原体。本研究选取10株来自江西省2010年AHC暴发疫情的CV-A24v,采用特异性引物扩增并测定其全基因组序列。对该10条CV-A24v的全基因组序列进行系统发育分析以及重组分析,计算本研究测定的江西10条以及GenBank中所有22条CV-A24v的全基因组序列的氨基酸置换熵值,并预测其正向选择位点。结果表明,在江西10条CV-A24v基因组序列中未检测到重组。基于全基因组序列构建的最大似然树表明江西10株CV-A24v属于GIV基因型,且分处于两条传播链。对上述32条CV-A24v序列的氨基酸置换熵值计算,共得到25个易突变位点(熵值>0.6),易突变概率最高的区段为2A区。基于Datamonkey中FUBAR和FEL模型分析,发现位于结构蛋白VP2区的234位氨基酸为两种模型共同获得的CV-A24v的正向选择位点。本研究分析了江西10株CV-A24v的全基因组序列特征,为CV-A24v引起的AHC防控工作提供了基础资料。     

丽水市早期新冠肺炎无症状感染者SARS-CoV-2全基因组序列分析

对1例新型冠状病毒肺炎疫情流行早期的无症状感染者临床标本进行SARS-CoV-2实验室鉴定和全基因组测定,在分子水平了解新型病毒的基因特点和变异情况,追溯病毒潜在来源.实时荧光定量PCR扩增丽水市庆元县首例确诊患者密切接触者的痰液标本SARS-CoV-2核酸,阳性RNA逆转录为cDNA构建文库后进行基于NGS的宏基因组深度测序,生物学软件分析处理数据.该密接无任何症状及体征,痰液标本SARS-CoV-2核酸阳性.测序数据包含有足够的病毒序列,组装成功后hCoV-19/Lishui/LS556/2020长29 887bp,G+C含量37.99％,在ORF1ab和N区域发现4个SNP,对应1个错义突变和3个同义突变.LS556与SARS-CoV-2参考序列核苷酸/氨基酸同源性在99.2％/97.4％以上,不同序列之间存在4～17个核苷酸差异,与蝙蝠病毒RaTG13核苷酸差异仅3.7％,存在1141个SNP,与穿山甲病毒Guangdong/1相似性90.9％.LS556属于β冠状病毒Lineage B谱系,与LS003和ZJU-06共享完全相同的病毒,与蝙蝠/穿山甲冠状病毒进化上最相关.结合流行病学、核酸诊断、病毒溯源判定其为无症状感染者.LS556组成和结构符合SARS-CoV-2典型的基因特征,为高覆盖率序列,在流行早期与其他SARS-CoV-2基因组具有高度的同一性,突变率保持在较低水平,多数导致氨基酸位点保守置换.     

草莓种苗壮苗指数模型的构建与质量评价

随着我国草莓栽培面积逐年增加,草莓种苗需求量越来越大,为了确保种苗育苗质量,亟需开展壮苗评价的研究。本研究以生长40 d的‘红颜’穴盘苗为对象,在测定地上部和地下部生长、鲜重、干重等16项指标的基础上,分别构建单项指标隶属函数,使用加权模糊评判法计算种苗综合评价指数;利用主成分分析筛选的关键指标组成多个壮苗指数模型,与种苗综合评价指数进行相关性分析后,确定最佳草莓壮苗指数模型并进行验证。结果表明: 随机选取的320株草莓种苗16项指标存在显著差异,综合评价指数为0.165～0.817,可作为壮苗指数模型构建和种苗质量评价的依据。主成分分析将16项指标划分为地上部相关指标、地下部相关指标和色素指标3个主成分,累计贡献率达到79.7%;从每个主成分中选择贡献值最大的3个指标随机组成27种壮苗指数模型,通过相关性分析筛选出与综合评价指数相关性最大的5个壮苗指数模型,其中“地上干重×根系表面积×叶绿素a”的相关性最高,用‘红颜’、‘香野’和‘甜查理’种苗验证相关系数均最大,分别为0.879、0.924和0.975,确定可作为草莓壮苗指数计算模型。以综合评价指数为种苗质量分级依据,可将种苗健壮程度分为3个等级:等级Ⅰ(综合评价指数≥0.5,壮苗指数≥4.0)为优质苗,等级Ⅱ(综合评价指数0.3～0.5,壮苗指数0.5～4.0)为合格苗,等级Ⅲ(综合评价指数≤0.3,壮苗指数≤0.5)为弱苗。研究结果可为草莓或其他种苗壮苗指数计算和种苗健壮程度评价提供理论依据与科学方法。     

西伯利亚蝗抗菌肽基因的克隆及表达特性研究

[目的]扩增西伯利亚蝗Gomphocerus sibiricus抗菌肽(attacin)基因,并对其进行生物信息学分析,同时分析西伯利亚蝗不同组织中抗菌肽基因的差异表达.[方法]基于RACE技术从西伯利亚蝗中克隆得到抗菌肽,利用生物信息学软件对西伯利亚蝗抗菌肽的一级结构、二级结构、三级结构、系统进化和亚细胞定位进行分析.采用实时荧光定量PCR技术检测了西伯利亚蝗抗菌肽基因在马氏管、中肠、后肠、脂肪体和唾液腺中的相对表达量.[结果]克隆获得的抗菌肽基因的开放阅读框为282 bp,编码93个氨基酸,其编码蛋白预测理论分子量为9.98 ku,等电点为9.26.抗菌肽氨基酸序列中存在信号肽序列.基因定量分析显示,抗菌肽基因在西伯利亚蝗的中肠中表达量最高.[结论]attacin在西伯利亚蝗成虫不同组织中差异表达,提示其消化道在防御病原微生物的入侵中起着重要的作用.     

抑制ATR基因可提高HeLa细胞对烷化剂的敏感性

目的：探讨ATR基因的表达对HeLa细胞对烷化剂敏感性的影响。方法：采用RNA干扰技术抑制HeLa细胞ATR基因的表达,观察ATR被阻断后HeLa细胞对烷化剂敏感性的变化,从而确定ATR基因的作用。结果：筛选到表达针对ATR基因的短发夹RNA（shRNA）阳性克隆,Western印迹结果显示ATR基因表达受到明显抑制;HeLa细胞对烷化剂的敏感性实验提示,ATR shRNA^＋HeLa细胞对烷化剂的敏感性明显增强。结论：抑制ATR基因可明显提高HeLa细胞对烷化剂的敏感性。     

响应面法对小球藻Chlorella zofingiensis高产虾青素条件的优化

采用析因设计法(Plackett-burman)对影响Chlorella zofingiensis高产虾青素的相关因素进行评价,发现硝酸钠、光照强度、二价铁离子及醋酸钠浓度对虾青素产量影响显著.利用中心组合设计(central composite design)及响应面分析对影响虾青素产量的关键因素做进一步的优化,得到较佳的试验点为二价铁离子浓度0.41 mmol/L,硝酸钠浓度0.8 mmol/L,醋酸钠浓度37.1 mmol/L,光照强度650 E/m2×s.优化后虾青素产量从7.890mg/L提高到19.81mg/L,比优化前提高了2.5倍.