重组GIP蛋白的原核优化表达及其生物活性的研究

葡萄糖依赖性促胰岛素多肽或抑胃肽(glucose-dependentinsulinotropicpolypeptideorgastricinhibitorypeptide,GIP)是由42个氨基酸组成的胃肠调节肽,在高血糖背景下能够刺激胰岛素释放,能够抑制胃酸分泌、促进神经细胞增生,具有广泛的临床应用价值.化学提取或人工合成GIP,成本过高,不宜规模化生产,故应用基因工程技术研制重组人GIP(rhGIP)并探讨其生物活性有积极的现实意义.人工合成具有大肠杆菌偏爱密码子的编码GIP成熟肽的cDNA序列,利用pET32a( )系统进行原核表达;在小规模发酵条件下,进行优化诱导表达和目的蛋白的亲和纯化;通过检测SD大鼠胃酸分泌和血糖浓度,对纯化后的rhGIP进行生理活性研究;通过形态学观察和培养基中NO含量测定,检测rhGIP对PC12细胞NO自由基生成量的影响;应用Aβ25-35加入培养基造成PC12细胞神经损伤模型,分别以高、中、低剂量rhGIP作用于此模型,通过MTT(2-(4,5-dimethylthia-zol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)法测定PC12细胞的活性.结果显示,成功克隆了人GIP基因,诱导表达的rhGIP占细胞总蛋白质的35%,部分可溶,部分以包涵体形式存在.经过诱导表达的重组蛋白质分子质量约为26ku,与理论值相符.纯化后的rhGIP具有免疫活性.优化诱导表达条件为表达菌生长密度A600值0.50,IPTG浓度0.5mmol/L,温度37℃,诱导表达时间4h.裂解上清液经固定化金属亲和层析一步法层析后,表达的水溶性rhGIP融合蛋白的最后得率为1.2mg/L菌液,纯度为85%.纯化后的rhGIP能够使SD大鼠胃液pH值增高,其抑制胃酸分泌作用与生理盐水对照组比较差异有显著性(P<0.05),而rhGIP组和标准品GIP组比较差异无显著性.在高血糖背景下,注射rhGIP15min后,大鼠血浆血糖浓度较基础血糖显著降低(P<0.05),30min时与单独注射葡萄糖的模型对照组比较,差异无显著性,而rhGIP组和标准品GIP组其差异不显著.在rhGIP对神经细胞的营养和对PC12细胞免受神经损伤和缺氧损伤影响的研究中发现,用rhGIP培养PC12细胞32h后,rhGIP组NO含量极显著低于正常对照组(P<0.01),细胞存活较多,神经突起延伸较好,中、高剂量rhGIP组均较神经损伤和缺氧损伤组活性显著升高(P<0.05),且细胞活性呈剂量依赖关系,rhGIP组与标准品GIP组差异不显著,与正常对照组亦无显著差异.研究结果表明,已得到高效表达的rhGIP融合蛋白,该蛋白质具有免疫活性,具有抑制胃酸分泌和降低大鼠血浆血糖浓度的生理活性,并且对神经细胞有营养和保护作用.     

菊苣根提取物的抑菌活性研究

采用离体的试验方法测定了菊苣根的石油醚、乙酸乙酯和乙醇提取物对7种植物病原真菌和3种细菌的抑制活性。采用盆栽试验方法测定了菊苣根提取物对小麦白粉病的防治效果。结果表明,乙醇和乙酸乙酯提取物均有一定的抑制植物病原真菌和细菌活性。且乙酸乙酯提取物效果更佳。在10 g.L-1浓度下,乙酸乙酯提取物能显著抑制小麦赤霉病菌、玉米大斑病菌和烟草赤星病菌3种病原真菌菌丝的生长,抑制率均在85%以上;对小麦根腐病菌、玉米大斑病菌和烟草赤星病菌的孢子萌发抑制率也均在80%以上;对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达21.01 mm和17.23 mm;对盆栽小麦白粉病的预防和治疗作用分别为50.93%和65.82%。     

中国主要入海河流河口集水区划分与分类

采用GIS技术开展中国主要入海河流的流域边界及其汇水单元、河口集水区的划分及其分类。基于ArcGIS水文分析模块划分出15条入海河流的汇水单元,并通过5种不同汇水单元面积等级的划分来表达各入海河流汇水单元的详细程度;划分的流域面积与相关文献资料对比偏差在10%以内;在流域与汇水单元划分的基础上,基于感潮河段的数据收集,确定出88个中国主要入海河流的河口集水区。通过建立分类指标体系,采用聚类分析方法,划分出5类河口:第一类EDA主要分布在环渤海地区、山东半岛和广东沿海;第二类EDA主要分布在长江口和杭州湾周围;第三类EDA主要分布在江苏北部沿海和辽东半岛;第四类包括山东江苏交界处沿海、江苏南部沿海;第五类主要分布在福建浙江沿海、珠江口、长江口、海河口附近、辽河河口附近,并利用快速生物评价法验证河口分类的合理性。研究成果可为进一步开展我国近海河口和海域营养盐基准制订与生态分区提供基础空间数据与方法借鉴。     

三只羊岩溶峰丛洼地果-药复合栽培模式研究

岩溶峰丛洼地的耕地可分为3种类型：洼底平地、带状阶梯地和高坡石穴地。传统的玉米＋黄豆种植模式在三种类型耕地上的产值均很低,需要调整品种结构,改革种植模式。该文报道了基于三种耕地特点的四种果一药复合种植试验,即沙田柚＋绞股蓝、大果枇杷＋射干＋扶芳藤、无核黄皮＋射干＋扶芳藤、四月桃＋金银花。初步结果显示,四种模式均可大幅度提高耕地的产值,可作为岩溶峰丛洼地地区生态农业可持续发展的重要模式。     

趋化因子及其受体家族分子适应性进化分析

Branch-Site模型是检测基因序列中单个密码子位点是否具有选择作用的统计学方法。该模型能有效地检测基因在进化历程中是否受到选择作用, 并预测出那些在进化过程中对功能分化有重要贡献的、受正选择作用的密码子位点。趋化因子是一类控制免疫细胞定向迁移的细胞因子, 其功能行使由趋化因子受体介导。该文用Branch-Site模型分析趋化因子及其受体基因家族的分子适应性, 发现只有少数种类基因受到正选择作用, 如RANTES、CCR5等。并预测出一些可能受到正选择作用的位点, 蛋白3D分析显示, 它们均位于趋化因子和相应受体相互作用的结构区域。     

生态贫困视角下的贫困县多维贫困综合度量

作为国家扶贫开发决策实施的重要单元,贫困县贫困程度及其致贫原因的识别和评估是国家“精准扶贫”战略实施的前提和保障.本文从生态贫困的视角,设计了顾及自然环境-经济-社会可持续协调发展的县级别多维贫困度量指标体系,构建基于贫困指数-最小方差模型(PI-MVM)的县级多维贫困度量模型,以6个连片特困区的249个县为典型研究区,系统揭示片区-县级层面上的贫困程度、致贫原因及其空间分布特征.结果显示: 各片区的综合贫困程度由北向南逐渐加重,各片区县存在“从北向南、从东到西,贫困程度逐渐加重”的趋势;乌蒙片区西部、秦巴片区西北部各县贫困程度的高-高聚集现象突出;秦巴中南部以及乌蒙片区受自然环境因素影响较大,贫困程度较深.一般致贫型片区县较多,主导致贫型片区县聚集在贫困程度较低的片区;经济因素对贫困的缓解作用逐渐下降,自然环境、社会发展因素的影响逐渐明显.研究结果可以更加精准地全面把握贫困县的贫困区划特征,为指导研究区早日脱贫提供辅助决策技术支撑.     

香菇顺式调控元件的克隆及其序列分析*

应用顺式调控元件探测载体G221构建了一个香菇Lentinula edodes基因组文库。G221为大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体,含有一个由酵母Cyc1基因基本启动子控制的lacZ标记基因,能以转录增强活性筛选香菇DNA片段。用这个基因组文库转化酵母菌,获得了一批lacZ阳性转化子。对其中表达较强的阳性转化子进行质粒抽提和双酶切鉴定,筛选到50个香菇顺式调控元件DNA片段。对其中部分片段进行了测序,并对其中一个序列进行了序列分析,鉴别了该序列上的几个与转录相关的特征序列。该研究也探讨了利用酵母表达系统克隆香菇顺式调控元件的可行性。     

淋病奈瑟菌肽基脯氨酰异构酶的原核表达及其作为候选疫苗的初步评价

【背景】淋病是我国主要的性传播疾病之一,感染淋病奈瑟菌可促进人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的传播和感染。目前我国淋病发病人数呈上升趋势,随着多重耐药菌株的出现,亟须研发保护性疫苗来防治淋病的传播和感染。【目的】分析淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae, NG)肽基脯氨酰异构酶(peptidyl-prolyl isomerase, PPIase)蛋白的高级结构和表位,探讨其作为疫苗和分子诊断靶点的潜力。【方法】利用生物信息学软件分析PPIase蛋白的极性、亲水性、柔韧性、表面可及性、二级和三级结构,以及T、B细胞表位等;用pET32a(+)质粒构建PPIase蛋白的原核表达系统并纯化蛋白,用纯化的重组蛋白和超声波破碎的NG全菌抗原分别免疫BALB/c小鼠,收获免疫血清;制备NG全细胞抗原,分别以全细胞抗原酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和间接免疫荧光试验检测重组PPIase蛋白血清抗体与NG全细胞表面抗原的结合情况。【结果】生物信息学分析结果显示,...     

抑制铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜形成的乳杆菌筛选及机制初探

筛选得到对慢性创面中铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生物膜形成具有抑制作用的乳杆菌(Loctobacillus)。测定不同种乳杆菌对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌双菌生物膜量、生长及群体感应信号分子AI-2的影响，并采用主成分分析和菌株特性综合分析确定效果最佳的菌株，最后通过荧光定量PCR的方式探究该菌株对生物膜和群体感应相关基因表达的影响。结果表明，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、卷曲乳杆菌(Loctobacillus crispatus)、嗜酸乳杆菌(Loctobacillus acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(Loctobacillus rhamnosus)、瑞士乳杆菌(Loctobacillus helveticus)、短乳杆菌(Loctobacilkus brevis)具有不同程度的抑菌、抑制生物膜形成的能力，且同种不同株的乳杆菌抑制生物膜形成的能力也有所差异。其中，植物乳杆菌CCFM233产生的AI-2信号分子较多，具有良好的抑菌能力，可使致病菌生物膜形成量降低，铜绿假单胞菌的LasR和rhlI基因表达水平和金黄色葡萄球菌的SarA基因表达水平显著下调。本研究旨在揭示植物乳杆菌CCFM233具有抗铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌感染的潜力，为其应用于慢性创面敷料提供参考。     

静脉溶栓时机对急性ST段抬高型心肌梗死患者溶栓效果及主要不良心脏事件发生率的影响

目的:探讨静脉溶栓时机对急性ST段抬高型心肌梗死患者溶栓效果及主要不良心脏事件发生率的影响。方法:将2016年1月至2017年12月我院接诊的314例急性ST段抬高型心肌梗死患者纳入本研究,按照溶栓治疗时间不同分为A组(发病至溶栓时间6 h)172例、B组(发病至溶栓时间为6～12 h)102例和C组(发病至溶栓时间12 h)40例,比较三组患者溶栓效果、溶栓后ST段回落情况以及住院期间主要不良心脏事件发生情况。结果:A组患者梗死冠脉溶通率、溶栓后ST段回落幅度高于B组和C组,且B组高于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。A组患者治疗后ST段回落最大幅度所需时间、住院期间主要不良心脏事件总发生率低于B组和C组,且B组低于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:急性ST段抬高型心肌梗死患者发病后6 h内静脉溶栓治疗梗死冠脉溶通率更高、ST段回落效果更好,可降低住院期间主要不良心脏事件发生风险。