An extracellular loop of the human non-gastric H,K-ATPase alpha-subunit is involved in apical plasma membrane polarization.

The human non-gastric H,K-ATPase, ATP1AL1, belongs to the gene family of P-type ATPases. Consistent with their physiological roles in ion transport, members of this group, including the Na,KATPase and the gastric and non-gastric H,K-ATPases, are differentially polarized to either the basolateral or apical plasma membrane in epithelial cells. However, their polarized distribution is highly complex and depends on specific sorting signals or motifs which are recognized by the subcellular targeting machinery. For the gastric H,K-ATPase it has been suggested that the 4(th) transmembrane spanning domain (TM4) and its flanking regions induce conformational sorting motifs which direct the ion pump exclusively to the epithelial apical membrane. Here, we show in transfected Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells that the related non-gastric H,KATPase, ATP1AL1, does contain similar sorting motifs in close proximity to TM4. A short extracellular loop between TM3 and TM4 is critical for this pump's apical delivery. A single point mutation in the corresponding region redirects ATP1AL1 to the basolateral membrane. In conclusion, our work provides further evidence that the cellular distribution of P-type ATPases is determined by conformational sorting motifs.     

Regenerating Sciatic Nerve Does Not Utilize Circulating Cholesterol

The rapid accumulation of myelin in the peripheral nervous system during the early postnatal period requires large amounts of cholesterol, a major myelin lipid. All of the cholesterol accumulating in the developing rat sciatic nerve is synthesized locally within the nerve, rather than being derived from the supply in lipoproteins in the systemic circulation (Jurevics and Morell, J. Lipid Res. 5:112–120; 1994). Since this lack of utilization of circulating cholesterol may relate to exclusion by the blood-nerve barrier, we examined the sources of cholesterol needed for regeneration following nerve injury, when the blood-nerve barrier is breached. One sciatic nerve was crushed or transected, and at various times later, the rate of cholesterol accumulation was compared with the rate of local in vivo synthesis of cholesterol within the nerve, utilizing intraperitoneally injected ³H₂O as precursor. The accumulation of additional cholesterol in nerve during regeneration and remyelination could all be accounted for by that locally synthesized within the nerve. There was also an increase in cholesterol esters in injured nerve segments; in crushed nerves, these levels decreased during regeneration and remyelination, consistent with reutilization of cholesterol originally salvaged by phagocytic macrophages and Schwann cells. Thus, regeneration and remyelination following injury in sciatic nerve utilizes both salvaged cholesterol and cholesterol synthesized locally within the nerve, but not cholesterol from the circulation.     

Partial purification of human placental 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase: Kinetic properties

The enzyme system, 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase, which catalyzes the first inactivation step in the catabolism of the prostaglandins has been isolated and purified 107-fold from human placenta. Kinetic studies reveal different Michaelis-Menten constants for most of the naturally occurring prostaglandins. The K_m for PGE₂ was found to be 10 μM, for PGE₁, 27 μM; for PGA₂, 32 μM; for PGA₁, 33 μM; and for PGF_2α 59 μM. The enzyme has a sharp pH-optimum between 7.5 and 8.8. Prostaglandin dehydrogenase appears to be isoenzymic as judged by separation on polyacrylamide disc gel electrophoresis. Inhibition studies with the partially purified enzyme indicate that progesterone and estrogen may influence the conversion of biologically active prostaglandins into the biologically inactive 15-ketoprostaglandins. These findings offer evidence for the control of prostaglandin metabolism in the human placenta.     

Die Entstehung des Farbmusters beim Lakenfelder Huhn

Zusammenfassung Das Gefieder des erwachsenen Lakenfelder Huhnes ist im großen ganzen schwarzweiß gescheckt, doch enthalten sowohl die schwarzen als auch die weißen Gefiederregionen stets eine mehr oder weniger große Anzahl von gemusterten Federn.Obwohl die Zeichnung dieser gemusterten Federn sehr variabel ist, behalten die Federn aus ein und demselben Follikel in aufeinanderfolgenden Federgenerationen ihr Muster jeweils bei.Das Kücken der Lakenfelder besitzt ein anderes Muster als das erwachsene Huhn. Wie ein Vergleich zwischen den Embryonen der einfarbig schwarzen Rheinländer und denjenigen der Lakenfelder zeigt, entstehen die Melanocyten bei der letztgenannten Hühnerrasse in viel geringerer Anzahl, besiedeln die verschiedenen Körperregionen verspätet und bilden auch weniger Pigment.Die langsamere Wanderung und die spätere Pigmentsynthese führen zur Ausbildung des Kückenmusters, während das Muster des erwachsenen Huhnes vor allem auf der verringerten Melanocytenanzahl beruht. Nur an denjenigen Körperstellen, die in unmittelbarer Nähe der beiden Entstehungszentren der Melanocyten, d. h. am Kopf und am Hinterende liegen, erhalten die Federanlagen so viele Pigmentzellen, daß hier schwarze Federn entstehen können. Die wenigen, weiterwandernden Melanocyten dringen nur noch hier und dort in einzelne Federkeime ein und führen so zu der Entstehung der in das weiße Rumpfgefieder eingestreuten mehr oder weniger stark gemusterten Federn.Auch in vitro bildet Embryonalgewebe von Lakenfeldern sehr viel weniger Melanocyten als gleichaltriges Gewebe von schwarzen Rheinländern.     

Untersuchungen zur Rolle der Folsäure im Stoffwechsel autotropher Zellen

Zusammenfassung In Massenkulturen von Chlorella pyrenoidosa wurde die Rolle der Folsäure im Stoffwechsel, besonders im Hinblick auf deren mögliche Beteiligung an frühen Vorgängen des photosynthetischen Kohlenstoffeinbaues, untersucht. Als spezifische Antimetaboliten der Folsäure-Biosynthese wurden Sulfonamide (Sulfanilamid, Sulfathiazol) eingesetzt.Bereits nach 24 Std Einwirkungsdauer ist eine deutliche Abnahme der Teilungsintensität zu verzeichnen. Parallel damit läßt sich eine etwas geringere Abnahme des Pigment-und Nucleinsäure-Gehaltes (Ges.-NS, RNS, DNS) der Zellen nachweisen. Demgegenüber liegt eine deutliche Blockierung der Substanzproduktion erst nach 48 Std Hemmdauer vor. Aus diesem unterschiedlich starken Hemmeffekt auf Teilungsintensität und Substanzproduktion resultiert eine beachtliche Zunahme der Zell-größe, die nach 96 Std Versuchsdauer beinahe den doppelten Wert der Ausgangsgröße erreicht.Bei gleichzeitiger Gabe von p-Aminobenzoesäure (10^-6 Mol/l) oder Folsäure (10^-5 Mol/l) zum sulfanilamidhaltigen Kulturmedium ist keine Hemmwirkung des Antimetaboliten auf den Stoffwechsel der Algenzellen nachweisbar.Die schädigende Wirkung des Sulfonamids ist reversibel; der Rückgang der Hemmung wird anfangs durch unterschiedliche PAB-Konzentrationen in abgestufter Weise gefördert. ¹⁴C-Fixierungsexperimente lassen eine Beteiligung von Folsäure-Coenzymen an primären Vorgängen der photosynthetischen C-Einlagerung als fraglich erscheinen, da die Fixierung, bezogen auf die Substanzproduktion, nur langsam zurückgeht. Die Abnahme der Fixierung wird als sekundäre Veränderung des für die Photosynthese notwendigen Enzymapparates gedeutet.

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Investigations concerning the role of folic acid in the metabolism of autotrophic cells

Summary The role of folic acid in metabolism was studied in mass cultures of Chlorella pyrenoidosa, especially with respect to its possible participation in early stages of photosynthetic CO₂-fixation. Sulfonamides (sulfanilamide, sulfathiazole) were used as specific antimetabolites in the biosynthesis of folic acid.After 24 hours the number of cell divisions was much more diminished than the pigment and nucleic acid content of the cells. Significant inhibition of mass production did not occur before 48 hours. This difference in the sensitivity of cell division and mass production towards the antimetabolite leads to a definite increase in cell size.Antimetabolites administered together with (10^-6 mol/l) p-aminobenzoic acid or (10^-5 mol/l) folic acid cause no inhibition.The harmful effect of the sulfonamide is strictly reversible; the speed of recovery depends on the p-aminobenzoic acid concentration. ¹⁴C-Fixation experiments gave no evidence for the participation of folic acid enzymes in primary processes of photosynthetic carbon uptake. The decline of the fixation rate may be interpreted as a secondary effect on the enzyme apparatus necessary for photosynthesis.The enormous increase of the sugar content in the individual cells indicates a general disturbance of the metabolism.

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Dissertation der Mathematisch-naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Tübingen.     

Die Regulation der RNS-Synthese in Farngametophyten Durch Licht

Zusammenfassung In einer früheren Arbeit wurde gezeigt (Ohlenroth und Mohr, 1963), daß sich die Vorkeime von Dryopteris filix-mas im Blaulicht zu normalen zweidimensionalen Prothallien mit einem relativ hohen Proteingehalt entwickeln. Im Hellrot hingegen bilden sich Zellfäden (= Protonemen) aus, deren Proteingehalt bei gleicher Photosyntheseleistung wesentlich geringer ist.In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, daß auch der RNS-Gehalt im Blaulicht stets größer als im Hellrot ist. Die blaulichtabhängige RNS-Zunahme setzt zeitlich früher ein als die Proteinzunahme.In Umsetzexperimenten von Hellrot nach Blau manifestiert sich die morphogenetische Umsteuerung der Protonemen zeitlich eher als die blaulichtabhängige Steigerung des Proteingehalts. Kasemir und Mohr (1965) konnten zeigen, daß es sich bei dem Blaulichtprotein in erster Linie um eine Vermehrung des Strukturproteins der Chloroplasten hanhandelt. Die blaulichtabhängige RNS-Zunahme dagegen ist spätestens zum Zeitpunkt der morphologischen Umsteuerung faßbar. Dieses Ergebnis wird dadurch gestützt, daß Blaulicht im Vergleich zu Hellrot rasch einen gesteigerten Einbau von ¹⁴C, als ¹⁴C-Uridin (U) geboten, in die RNS-Fraktion verursacht. Das Blaulicht scheint in den Farnvorkeimen zwei verschiedene Vorgänge zu verursachen. 1. Steigerung einer autonomen Proteinsynthese in den Chloroplasten. 2. Auslösung oder Steigerung einer spezifischen Enzymsynthese im Cytoplasma. Die blaulichtabhängige Steigerung der RNS-Synthese scheint damit in Zusammenhang zu stehen. Die Daten der vorliegenden Arbeit werden als Indizien dafür angesehen, daß das Blaulicht seine morphogenetische Wirkung über eine differentielle Genaktivierung ausübt.

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The regulation of RNA synthesis in fern gametophytes by light

Summary Morphogenesis and metabolism of the gametophytes (= sporelings) of the common male fern Dryopteris filix-mas are controlled by visible radiation. Short wavelengths visible radiation (= blue light) leads to an increase in protein synthesis and makes possible the formation of normal two-dimensional prothallia. Under long wavelengths visible radiation (= red light) the sporelings grow as cellular filaments the protein contents of which are markedly lower than under blue irradiation even under conditions of equal rate of dry matter accumulation in red and blue (Ohlenroth and Mohr, 1963). — It is shown in the present paper that the RNA content of sporelings of the same age is always higher in blue light than in red light (Figs. 1, 3). The blue-dependent increase of RNA occurs faster than the blue-dependent increase of protein (Fig. 2). Furthermore the increase of protein per sporeling is much larger than the increase of RNA (Fig. 4). These facts are in agreement with the hypothesis that in some way or another blue light initiates differential gene activation.The blue light-dependent morphological changes which occur if we put red grown filamentous sporelings under blue light can be measured much faster than the blue light-dependent increase of the bulk protein (Figs. 5, 6). We have to conclude as we did in a previous paper (Kasemir and Mohr, 1965) that the blue light-dependent increase in the protein content of the sporelings might be mainly due to an increase of chloroplast protein. — The blue light-dependent increase of the RNA content occurs at least as fast as the morphological changes (Figs. 5, 6). This finding is supplemented by the observation (Fig. 8) that blue light markedly and rapidly stimulates the incorporation of ¹⁴C into RNA. The ¹⁴C was applied as ¹⁴C-uridine (U). — It seems that blue light causes an increase of protein synthesis in the chloroplasts as well as in the cytoplasm. Blue light-dependent RNA synthesis seems to be involved in this response. These data support the view that blue light might exert its morphogenetic control through differential gene activation.

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Die Arbeit wurde durch Sachbeihilfen der Deutschen Forschunggemeinschaft und der Stiftung Volkswagenwerk gefördert.     

Acyldepsipeptide antibiotics kill mycobacteria by preventing the physiological functions of the ClpP1P2 protease

The Clp protease complex in Mycobacterium tuberculosis is unusual in its composition, functional importance and activation mechanism. Whilst most bacterial species contain a single ClpP protein that is dispensable for normal growth, mycobacteria have two ClpPs, ClpP1 and ClpP2, which are essential for viability and together form the ClpP1P2 tetradecamer. Acyldepsipeptide antibiotics of the ADEP class inhibit the growth of Gram‐positive firmicutes by activating ClpP and causing unregulated protein degradation. Here we show that, in contrast, mycobacteria are killed by ADEP through inhibition of ClpP function. Although ADEPs can stimulate purified M. tuberculosis ClpP1P2 to degrade larger peptides and unstructured proteins, this effect is weaker than for ClpP from other bacteria and depends on the presence of an additional activating factor (e.g. the dipeptide benzyloxycarbonyl‐leucyl‐leucine in vitro) to form the active ClpP1P2 tetradecamer. The cell division protein FtsZ, which is a particularly sensitive target for ADEP‐activated ClpP in firmicutes, is not degraded in mycobacteria. Depletion of the ClpP1P2 level in a conditional Mycobacterium bovis BCG mutant enhanced killing by ADEP unlike in other bacteria. In summary, ADEPs kill mycobacteria by preventing interaction of ClpP1P2 with the regulatory ATPases, ClpX or ClpC1, thus inhibiting essential ATP‐dependent protein degradation.