GAL4/UAS系统在果蝇Tis11基因RNA干扰中的应用

TTP在哺乳动物许多关键基因表达的转录后水平上起调控作用,Tis11是TTP蛋白在果蝇中的同源物.目前还没有现成的可用于研究Tis11功能的基因敲除或敲低的果蝇.为了获得肌动蛋白启动子或者热激蛋白启动子驱动表达Tis11 mRNA干扰序列的具有较高干扰效率的Tis11基因干扰果蝇,将肌动蛋白启动子或者热激启动子驱动表达的GAL4果蝇品系与融合有Tis11 mRNA干扰序列的UAS品系杂交,收集同时带有GAL4基因和UAS序列的子一代果蝇.提取所收集果蝇的总RNA,将其中的mRNA逆转录成cDNA,并设计检测Tis11基因的特异性引物,然后通过Real-time PCR检测Tis11 mRNA的表达情况.结果显示所收集的能表达Tis11基因干扰序列的子一代果蝇与不能表达Tis11基因干扰序列的对照果蝇相比,其体内Tis11 mRNA的表达水平下降明显.收集的果蝇其体内所表达的干扰序列对Tis11 mRNA干扰效果显著,我们成功获得了Tis11基因的RNA干扰果蝇.     

浓核病毒分子生物学特性研究进展

浓核病毒是只感染无脊椎动物的细小病毒.该病毒颗粒直径为19～24 nm,无囊膜包裹,呈二十面体对称.病毒基因组为4～6 kb的单链线性DNA,基因组末端是与DNA复制相关的反向重复序列.浓核病毒的基因组包含编码非结构蛋白和衣壳蛋白的基因.对近年来关于浓核病毒分子生物学方面的研究取得的新进展进行了综述,介绍了浓核病毒基因组结构的分类和单双义浓核病毒的表达策略,以及浓核病毒在作为表达载体和生物防治方面的潜在应用能力.     

一种高效的单质粒模式四环素诱导表达系统的构建

现有的四环素诱导调控系统基于两个单独的质粒分别表达反式结合蛋白和外源基因.其缺点是在建立转基因定量表达动物模型时,需要制备和维持两个动物品系,再进行杂交才有可能获得双转基因后代,步骤繁琐,难度较大.针对上述缺陷,本研究尝试将反式蛋白rtTA表达框和低背景响应元件Ptight组装到同一个载体上,构建为严谨型单载体模式的诱导表达系统pTRE-Tight-rtTA,并通过两种报告基因的表达对其调控活性进行了研究.含有荧光素酶和绿色荧光蛋白的pTRE-Tight-rtTA-Luc和pTRE-Tight-rtTA-EGFP报告载体分别转染猪肾PK15细胞并经强力霉素处理,均可成功诱导报告基因的定量表达.在等摩尔转染条件下,单载体系统的诱导效率明显高于双载体系统（Dox-1 000 ng,10 倍;Dox-10 000 ng,8 倍）.该诱导型单载体系统的成功构建为外源基因的定量表达提供了新手段,为转基因定量表达动物模型的研究提供了新策略.     

绵羊基因组MHC ClassⅢ区段部分基因的分离与鉴定

绵羊基因组MHC段分为ClassⅠ、Class Ⅲ和ClassⅡ（含Ⅱa和Ⅱb两个亚区）3个区段,与另外2个区段相比,Class Ⅲ区的基因信息远少于ClassⅠ和ClassⅡ区.为丰富绵羊基因组 MHC Class Ⅲ 区段基因信息. 本研究用位于中国美利奴羊基因组BAC文库中 MHC ClassⅢ 区段4个BAC克隆的酶切片段制备32P 标记探针,继而采用噬菌斑原位杂交筛选法筛选中国美利奴羊混合组织cDNA 文库,并对分离到的cDNA 阳性克隆进行全序列测定及生物信息学分析.本实验共筛选出 31 个 cDNA 阳性克隆,对其序列进行了测定及分析,确定了序列在ClassⅢ 区段上的位置,并通过在NCBI中的同源检索对其功能做了初步鉴定.由实验可知,利用BAC 文库与 cDNA 文库杂交筛选法对较大区段基因的筛选和分离是有效的.同时,对分离到的表达序列结合生物信息学进行分析,这将有助于对该序列功能的深入研究.     

基于功能基因组数据整合方法研究前列腺癌风险基因

目的:利用生物信息学方法,将高通量基因表达数据与单核酸多肽(SNP)基因型数据进行整合分析,研究并注释前列腺癌风险基因。方法:本文基于EST、SAGE、基因芯片三类功能基因组数据整合的方法研究前列腺癌风险基因。首先,通过三类数据寻找前列腺癌中异常表达和差异表达基因。利用全基因组关联分析得到前列腺癌相关基因的SNPs。定位所得到的前例腺癌差异表达基因与SNPs到染色体,获取与SNPs在同一区段的差异表达基因,并通过各种数据库注释所得基因。结果:通过数据整合分析,最终得到前列腺癌风险基因84个,其中20多个基因已被证实与前列腺癌极其相关。结论:整合前列腺癌高通量表达数据与SNP基因型数据,能够快速有效的获得前列腺癌显著相关基因。此方法可以推广于其它癌症的研究。     

美常安治疗老年人抗生素相关性腹泻的疗效观察

目的:观察美常安治疗老年人抗生素相关性腹泻的疗效.方法:将79例老年人抗生素相关性腹泻患者随机分为2组,对照组为常规治疗,治疗组在常规治疗的基础上加用美常安治疗.结果:治疗组患者的总有效率明显高于对照组,2组有显著差异(P＜0.05).结论:美常安治疗老年人抗生素相关性腹泻疗效显著.     

大白兔VX2肝癌模型制作优化研究

目的:改进大白兔VX2肝癌模型制作方法并研究肝癌组织缺血再灌注后的损伤作用。方法:用特殊技术方法制备高浓度细胞悬液,分别以27号注射针头向动物肝脏左中叶注射0.3 mL,制成动物肝癌模型。待肿瘤细胞种植成功至实验标准后,阻断肝左中叶之供血和门静脉60分钟,恢复血流至各个实验时间点。检测癌组织中CAT和SOD浓度的改变和细胞凋亡情况。结果:全部动物肝脏VX2细胞悬液注射后均种植成功但每组动物中有2-3只出现肿瘤细胞外溢和种植。种植成功之肿瘤组织缺血再灌注后CAT浓度明显降低且至1天达最低水平。SOD浓度在正常肝组织和肝癌组织中均明显降低而肝癌组织在再灌注后7天气浓度仍然保持较低水平。在正常肝组织和肝癌组织中肿瘤细胞凋亡均有增加,但在后者更为显著。结论:以特殊外科方法直接向肝组织内注射VX2细胞悬液能够成功制作大白兔肝癌模型。缺血再灌注可以导致组织的细胞凋亡,但对肝癌组织的影响更大。     

胆碱酯酶在乙肝肝硬化患者肝脏储备功能的评估应用

目的:研究胆碱酯酶(CHE)在评估乙肝肝硬化患者肝脏储备功能中的应用价值。方法:收集501例肝硬化患者病例,并根据肝脏功能进行Child分级。应用全动自动生化分析仪,以酶速率比色法检测胆碱酯酶(CHE),溴甲酚绿法检测白蛋白(ALB),凝固法检测凝血酶原时间(PTs)。应用方差分析,研究胆碱酯酶(CHE)在不同CHILD分级组别中的肝功能评价意义。应用相关分析方法,比较胆碱酯酶(CHE)与其他肝脏合成指标白蛋白(ALB)、凝血酶原时间(PTs)的相关性。结果:肝硬化患者在严格Child-Pugh分级标准划分而成的ABC三级中,各级胆碱酯酶(CHE)活性逐级明显下降,分别为5469.04±1777.31 U/L(Child A),2935.08±1206.95 U/L(Child B),1810.40±724.72 U/L(Child C),且结果差异有显著意义(F=261.114,P=0.000)。在肝硬化患者中,胆碱酯酶(CHE)与白蛋白(ALB)总体正相关、与凝血酶原时间(PTs)总体负相关。其中Child A级患者中,CHE与ALB成正相关,与PTs负相关。Child B级患者中,CHE与PTs负相关,但与ALB无显著相关性。Child C级患者中,CHE与ALB正相关,但与PTs无显著相关性。结论:胆碱酯酶(CHE)与肝硬化患者肝细胞损害的严重程度相关,可反映肝脏的储备功能,与白蛋白(ALB)、凝血酶原时间(PTs)有同样重要的价值。     

“互动式”教学模式在生理学教学中的探索

针对医学生理学理论性强、内容抽象,学生课堂积极性差的特点,采用以教师为主导,以学生为主体的"互动式"教学模式,通过多种教学方法在生理学教学中灵活应用,激发学生课堂学习的主动性、积极性,培养了学生的创新意识和科研思维能力,取得了较好的教学效果.     

大鼠髓核细胞原代培养及表型鉴定

目的:探讨Ⅱ型胶原酶联合透明质酸酶消化分离培养髓核细胞及免疫细胞化学表型鉴定的可行性。方法:无菌条件下分离SD大鼠凝胶状髓核,采用Ⅱ型胶原酶联合透明质酸酶消化分离髓核细胞并连续培养,倒置相差显微镜下观察,随后进行免疫细胞化学染色检测不同代次髓核细胞HIF-1、Ⅰ、Ⅱ型胶原、MMP2及蛋白聚糖的表达情况,并给予MTT法测定髓核细胞生长曲线。结果:Ⅱ型胶原酶联合透明质酸酶分离培养原代髓核细胞需要12 d左右贴壁,达95%融合需要34 d,而传代髓核细胞贴壁速率明显增快至10 h,且其倍增时间约为2.5 d;免疫细胞化学显示髓核细胞均表达HIF-1、Ⅰ、Ⅱ型胶原、MMP2和蛋白聚糖,且随着髓核细胞传代其HIF-1α、HIF-1β、Ⅰ型胶原及MMP2表达均增加,但Ⅱ型胶原表达降低,而蛋白聚糖表达无明显差异;MTT法显示随着髓核细胞传代其增殖有所减缓。结论:Ⅱ型胶原酶联合透明质酸酶可成功分离髓核细胞,提高培养效率,且HIF-1α、HIF-1β、Ⅰ、Ⅱ型胶原及MMP2可作为髓核细胞表型分子用于髓核细胞的鉴定。