APRT缺陷型CHO细胞系的建立及其重组蛋白表达能力评价北大核心CSCD

中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是生产复杂重组药物蛋白的首选宿主细胞,腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyltransferase,APRT)催化腺嘌呤与磷酸核糖缩合形成腺苷一磷酸,是嘌呤生物合成步骤中的关键酶。采用基因编辑技术敲除CHO细胞中aprt基因,验证获得的APRT缺陷型CHO细胞系的生物学特性;构建两种真核表达载体:对照载体(含有目的基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和弱化载体(含有启动子和起始密码子突变的aprt弱化表达盒及EGFP),分别转染APRT缺陷型和野生型CHO细胞并筛选获得稳定转染的细胞池;重组CHO细胞传代培养60代并用流式细胞术检测EGFP表达的平均荧光强度,并比较不同实验组重组蛋白EGFP的表达稳定性。PCR扩增和测序结果表明,CHO细胞aprt基因成功敲除;获得的APRT缺陷型CHO细胞系在细胞形态、生长增殖、倍增时间等生物学特性方面与野生CHO细胞无显著差异。目的蛋白瞬时表达结果表明,与野生型CHO细胞相比,转染对照载体和弱化载体的APRT缺陷型CHO细胞系中EGFP的表达分别提高了42%±6%和56%±9%;特别是长期传代培养时,转染弱化载体的APRT缺陷型细胞中EGFP表达量显著高于野生型CHO细胞(P<0.05);构建的基于APRT缺陷型CHO细胞系能够明显提高重组蛋白的长期表达稳定性。研究结果为建立高效稳定的CHO细胞表达系统提供了一种有效的细胞工程策略。     

温度对中华鲟幼鱼血液生化指标的影响

分别在15℃、20℃、25℃和30℃水温养殖中华鲟幼鱼66d,研究温度对中华鲟幼鱼8项血液生化指标的影响。结果表明:中华鲟幼鱼血液中能源物质总蛋白、白蛋白、血糖、总胆固醇和高密度脂蛋白浓度变化规律相似,均呈现先升高后降低的趋势,而且均在20℃时达到最高值,分别为15.98g·L-1、5.6g·L-1、4.85mmol·L-1、2.44mmol·L-1和0.61U.L-1;在30℃时血液总蛋白、白蛋白、血糖、总胆固醇和甘油三酯浓度达到最低值,分别为8.93g·L-1、3.1g·L-1、2.26mmol·L-1、1.34mmol·L-1和3.35mmol·L-1;代谢产物总胆红素浓度呈现先降低后升高的趋势,在15℃组最高,在25℃组最低,分别为2.50±0.84和1.65±0.10mmol·L-1;尿素浓度随着温度升高而下降,在30℃时最低,为0.54±0.36mmol·L-1,显著低于15℃组和20℃组。综合不同温度组中华鲟幼鱼血液生化指标的变动规律表明,20℃时中华鲟幼鱼能量支出较少,是其较适宜的生长温度。     

14-3-3参与apelin-13促进大鼠血管平滑肌细胞增殖ERK1/2信号途径研究

本室以前已经报道了G蛋白偶联受体APJ的内源性配体多肽,apelin-13,通过激活ERK1/2促进大鼠血管平滑肌细胞增殖.本文研究14-3-3信号蛋白是否参与apelin-13促进大鼠血管平滑肌细胞增殖ERK1/2信号途径,探讨apelin/APJ系统的细胞信号转导机制.组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMCs;Western blotting方法检测14-3-3、pRaf-1、Raf-1、pERK1/2、ERK1/2、cyclinD1、cyclinE的表达;MTT方法观察14-3-3抑制剂Difopein对VSMCs的增殖作用;免疫共沉淀方法检测14-3-3和Raf-1蛋白复合物的形成.Western blotting方法结果显示,apelin-13(0、0.5、1、2、4μmol/L)浓度依赖性刺激大鼠VSMCs 14-3-3表达、Raf-1和ERK1/2磷酸化,以2μmol/L最为明显;2μmol/L apelin-13时间依赖性刺激大鼠VSMCs 14-3-3表达、Raf-1和ERK1/2磷酸化,在4 h增加最为显著;14-3-3蛋白抑制剂Difopein明显抑制apelin-13诱导的Raf-1磷酸化、ERK1/2磷酸化、cyclinD1及cyclinE表达;免疫共沉淀方法发现apelin-13诱导14-3-3与Raf-1结合增加,而Difopein明显抑制两者结合;MTT法显示Difopein明显抑制apelin-13诱导的血管平滑肌细胞增殖.上述结果表明,Apelin-13通过14-3-3/Raf-1复合物-ERK1/2信号转导通路促进大鼠血管平滑肌细胞增殖.     

臭氧浓度升高对香樟叶片光合色素及抗过氧化的影响及其氮素响应

为阐明氮(N)沉降条件下我国亚热带典型常绿树种香樟(Cinnamomum camphora)的臭氧(O3)胁迫响应特征,以1年生幼苗为试验对象,采用开顶气室(OTC)进行模拟研究。O3处理设大气O3(AA)、大气O3+60 nmol/mol(AA+60)、大气O3+120nmol/mol(AA+120)3个水平;N素以硝酸铵(NH4NO3)溶液形式施加,施N量设0(N0)、30(N30)、60(N60)(kg.hm-.2a-1)3个水平。主要考察了叶片膜质过氧化、光合色素、胞质抗坏血酸含量及总抗氧化能力的胁迫响应特征。结果表明:一个生长季(2009年5月15日—2009年9月10日)高浓度O3处理导致试验幼苗叶肉细胞膜脂过氧化程度显著加剧,叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量显著降低;N素施加显著提高了叶绿素含量,但未改变细胞膜脂过氧化水平。叶片总抗氧化能力在AA+120处理下显著提高,但未受N施加影响。还原型抗坏血酸含量在N0处理下随O3浓度升高而降低;在N30及N60处理下随O3浓度升高而增高。施N可通过提高叶片抗坏血酸含量来增强香樟对O3升高的适应能力。研究结论可为O3与N复合污染下,我国亚热带地区典型常绿树种的保护提供科学参考。     

苏北沿海滩涂养殖湿地磷化氢的释放及其影响因素

利用静态暗箱采样方法和气相色谱-氮磷检测器(GC-NPD)分析技术测定了苏北沿海滩涂养殖湿地区域磷化氢的释放通量,研究了其季节和空间变化特征,并探讨了其潜在的影响因素。结果表明,各季节磷化氢释放通量的高低排序为:8月份5月份11月份2月份,其变化范围分别为16.5—168.9、8.3—105.9、8.2—64.5和-19.5—49.6 ng m-2h-1,平均值分别为65.0、36.5、25.9和16.4 ng m-2h-1;空间变化明显,各季节的平均值,b10站位最高,b3次之,b5和b8站位相对较低。磷化氢释放通量与沉积环境因子的相关性分析显示,释放通量与TP、IP、OP、OC、TN、SC和T有较好的线性正相关关系(相关系数R分别为0.807、0.579、0.828、0.825、0.467、0.605和0.551,P值0.01),与Eh有较好的线性负相关关系(R为-0.774,P值0.01),表明在研究调查区域,较高的磷、碳、氮、硫组分含量,较高的温度和较低的氧化还原电位更有利于磷化氢的释放过程。     

河北承德地区两个温泉中细菌的多样性分析

通过构建16S rDNA克隆文库,对承德地区两温泉中的细菌多样性水平及系统发育关系进行了初步研究。研究表明:68°C的A11文库中阳性克隆的16S rDNA序列分属5个细菌类群,分别为Firmicutes(6.25%)、Deinococcus-Thermus(25.0%)、Gammaproteobacteria(12.5%)、Betaproteobacteria(50.0%)、Alphaproteobacteria(6.25%);而74.5°C的A12文库仅属于一个细菌类群:厚壁菌门(Firmicutes)。两温泉中细菌多样性的差异表明,温度是影响温泉中细菌多样性水平的重要因素。此外,A11文库中克隆的16S rDNA序列与许多已知的可产色素的好氧菌相似性很高,而A12文库中的细菌多数为专性厌氧或兼性厌氧型,其中厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)中的Anoxybacillus flavithermus可以作为研究泉华形成的理想材料。     

气候因素对黑线姬鼠种群动态影响的非线性效应

受全球气候变化的影响,气候因素与害鼠种群变化之间的关系成为害鼠防治研究中的热点问题。以西安市长安区周边分布的黑线姬鼠为研究对象,通过标志重捕法进行种群动态监测,掌握其种群数量的动态变化规律,并结合非线性的统计方法广义可加模型,对该地区2015—2018年黑线姬鼠种群密度和气候因素数据进行分析,探讨该鼠种群变化与气候因素之间的关系。结果表明,该地区黑线姬鼠种群数量总体显现为下降趋势。黑线姬鼠种群密度存在显著的正向自我调节效应(F_(1.00, 5.77)=27.062,P0.01),且与上一月种群密度存在线性的正相关。当月平均温度与该鼠种群密度之间存在显著的非线性效应(F_(1.90, 5.77 )=4.696,P0.05),两者之间显现为钟型关系,当温度21℃时,两者之间显现为正相关,黑线姬鼠种群密度随温度的升高而升高,反之显现为负相关。当月累计降雨量与其种群密度之间也存在显著的非线性效应(F_(1.87, 5.77)=3.879,P0.05),同样,两者之间也显现为钟型关系,当降雨量90 mm时,两者之间显现为负相关,种群密度随降雨量的增加而降低,反之显现为正相关。因此,温度和降雨对黑线姬鼠种群变化具有调节作用,低温干旱和高温多雨均不适合该鼠的繁殖与生长。     

杜仲细胞悬浮培养产黄酮及其动力学研究

本文应用正交设计对杜仲细胞悬浮培养的基本培养基和植物生长物质浓度进行了筛选,并对影响杜仲细胞悬浮培养和总黄酮含量的不同因素进行了考察。结果表明,B5培养基+0.5mg/L NAA+0.6mg/L 6-BA、蔗糖30g/L、初始pH 5.0-5.5、接种量20g(FW)/L以及摇床转速110r/min为杜仲细胞悬浮培养的适宜条件。通过对杜仲悬浮细胞生长和代谢动力学的分析表明：杜仲细胞悬浮培养生长符合Logistic生长模型,最大比生长速率( m)为0.417d-1;细胞基于蔗糖的真正比生长得率(YG)与维持系数(m)分别为0.619g/g和0.0206g/(g·d-1);黄酮合成属部分生长耦联型,可用Luedeking-Piret模型进行描述。研究结果为杜仲细胞大规模悬浮培养生产天然活性成分奠定了基础。     

人类疱疹病毒6型特异性CD4+ T细胞的初步克隆

目的 克隆HHV-6特异性CD4⁺ T细胞,并分析其基本特征。方法 微孔有限稀释法克隆HHV-6特异性CD4⁺ T细胞;3H-TdR掺入法细胞增殖试验筛选HHV-6 特异性CD4+ T细胞克隆;FACS分析HHV-6特异性CD4⁺ T细胞克隆的表面标志;ELISA检测HHV-6特异性CD4⁺ T细胞克隆的细胞因子分泌水平。结果 获得的细胞克隆中有4株以HHV-6感染细胞裂解物特异的方式增殖,并且其增殖水平与HHV-6感染细胞裂解物呈剂量依赖性;细胞克隆表面标志为CD3⁺CD4⁺;W-2和W-4细胞克隆的细胞因子分泌以IL-10为主,W-1细胞克隆的细胞因子分泌以IL-10及IFN-γ为主,W-3细胞克隆的细胞因子分泌以IFN-γ为主。结论 初步建立HHV-6特异性CD4⁺ T细胞克隆,并分析其表面标志和细胞因子分泌水平,为HHV-6特异性Treg细胞的克隆、筛选及其功能的研究奠定基础。     

陕西宝鸡发现喜山鼠耳蝠

2011年4和8月及2014年4月在陕西省宝鸡市太白县分别采集到2只、1只和1只共4只蝙蝠个体,标本保存于陕西省动物研究所标本馆(标本编号为TB0001、TB0002、TB0017和TB0042)。其主要形态特征为：体型小,头体长34.59 ~ 43.86 mm(n = 4);耳较小,黑色;耳前缘近凸圆,耳后缘在基部有一浅的缺刻;耳屏细长,约为耳长的一半;后足不及胫长的一半;背部毛基黑色,毛尖为赤褐色;腹部毛基为黑色,毛尖为灰褐色;翼膜起始于后足外趾的基部。以上特征均与喜山鼠耳蝠moupinensis亚种(Myotis muricola moupinensis)相符。结合线粒体Cyt b基因序列,构建其系统发生关系,与基因库中宽吻蝠属未定种(Submyotodon sp.)序列聚为较高支持度的一支。综合形态与系统发育证据,参考目前最新的中国兽类物种分类和分布信息,将采集到的标本初步鉴定为喜山鼠耳蝠moupinensis亚种,此次发现是陕西省境内该物种的首次记录,拓展了对其在我国分布范围的认识。