shRNA随机文库结合TK自杀基因筛选靶向HIV-1LTR相关宿主因子

构建shRNA随机文库与HIV-1 LTR启动胸苷激酶基因(TK基因)稳定表达的稳定细胞系HEK293/TK,将两者结合起来,筛选靶向HIV-1 LTR相关宿主因子.方法:通过化学合成含有19个随机脱氧核苷酸的发夹结构,将其退火补平后与合成的接头Linker连接进行PCR反应,将PCR产物酶切后置于慢病毒载体pLenti-U6启动子下游由此构建shRNA随机文库;利用重叠PCR将HIV-1 LTR片段和TK基因连接起来,连接产物经酶切后与pcDNA3.1载体连接;将连接正确的质粒转染HEK293细胞同时用G418加压筛选获得稳定细胞系HEK293/TK;将所获得的文库质粒包装成慢病毒后侵染所构建的HEK293/TK细胞系,通过加入药物GCV进行加压筛选获得存活细胞.结果:成功筛选到加药后存活下来的细胞,抽提细胞基因组,采用巢式PCR扩增目的干扰序列并用Western blot对干扰序列进行验证,鉴定获得一个克隆所表达的shRNA能对TK基因的表达起到抑制作用,通过测序分析获得其干扰序列,该序列很有可能针对HIV-1 LTR某宿主相关因子.结论:成功构建了一种筛选HIV-1 LTR相关宿主因子的方法,筛选所得序列可以定位到具体相关宿主因子,为靶向筛选抗HIV-1药物提供了重要手段.     

分枝杆菌噬菌体重组系统及其应用

噬菌体是微生物遗传学研究的有力工具及源泉.分枝杆菌噬菌体也是构建分枝杆菌,尤其是结核分枝杆菌遗传研究工具的基础.目前,基于分枝杆菌噬菌体重组酶的重组系统是国际热点.总结了近年来基于分枝杆菌噬菌体Che9c重组酶gp60、gp61所构建的分枝杆菌重组工程体系及其在分枝杆菌基因组研究方面的应用,并结合实验室工作展望了其研究前景.该体系不依赖细菌自身的RecA系统,不需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶,不需要复杂的体外操作,只需表达分枝杆菌噬菌体重组酶,从而使结核分枝杆菌基因敲除、基因敲入及点突变和构建分枝杆菌噬菌体突变株更方便.这为分枝杆菌及其噬菌体基因诱变及基因功能研究提供了迅捷的新途径.     

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体

目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白( alpha-crystallin Acr)的人源抗体.方法:以结核分枝杆菌Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核分枝杆菌Acr蛋白的抗体,并对可变区序列进行了测序分析.将特异性的噬菌体抗体感染HB2151菌,经IPTG诱导表达,制备了抗结核分枝杆菌Acr蛋白的可溶性单链抗体;对其序列和抗原结合活性进行分析鉴定.结果:经过4轮筛选,获得了43个与结核分枝杆菌Acr蛋白结合的阳性克隆,其中29个特异结合的克隆;测序分析有26不同的可变区片段;通过可溶性单链抗体(scFv)表达筛选到14株特异性结合Acr蛋白的可溶性单链抗体克隆;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群.成功制备了可溶性单链抗体.Westren blotting分析证实筛选的人源单链抗体能与天然蛋白结合.结论:利用单链大容量抗体库获得抗结核分枝杆菌Acr蛋白的噬菌体抗体并且成功制备抗结核分枝杆菌Acr天然蛋白的可溶性单链抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

葡萄种质资源初级核心群的构建

以国家果树种质郑州葡萄圃保存的867份栽培种质为材料,对47项表型性状进行了主成分分析。采用欧氏遗传距离、离差平方和法进行种质初选。采用分组和逐步聚类法,分别以15%、20%、25%和30%的比例抽样,依次获得124、170、205和252份种质。通过对初选种质的遗传多样性指数、表型保留比例的分析,检验初级核心群的构建效果。结果表明,按种质类型分组,组内采用平方根策略、15%抽样比例获得的124份初选种质的表型保留比例和遗传多样性代表性均达到96%,表明构建的初级核心群对原始种质具有很好的代表性。     

山东小麦地方品种资源铁和锌含量分析

利用等离子体发射光谱仪,对426份山东小麦地方品种资源进行了铁和锌微量元素含量的测定,摸清了山东省小麦地方品种资源铁和锌含量的分布情况。结果表明,山东小麦地方品种资源铁含量的分布范围为5.2～44.1mg/kg,锌含量的分布范围为6.2～50.4mg/kg。铁含量最高的种质是土耳其和落麦,分别为44.1mg/kg和41.8mg/kg;锌含量最高的种质是大青芒,为50.4mg/kg。利用这些铁锌含量高、子粒商品性及面制品口味好的小麦地方品种作育种亲本,对培育子粒中富含铁锌微量元素的高营养小麦新种质,具有十分重要的意义。     

华西雨蛙寄生多盘虫科单殖吸虫一新种

在云南省新平县(24°N,101°32’E)采集的华西雨蛙Hyla a.annectans膀胱内检获多盘虫属1新种,新平多盘虫Polystoma xinpingensis sp.nov.。124只华西雨蛙中18只华西雨蛙感染,自然感染率为14.5%。新种与多盘虫属记录种最显著的区别在于:虫体体型小,其体长仅为2967μm。内侧肠管于虫体后1/3处仅形成2条横跨虫体的联合肠管,其它记录种肠管分支多数或形成较复杂的网状。睾丸巨大,呈滤泡状,分散分布直达虫体中部。新种的正、副模式标本保存在云南师范大学生命科学学院。     

家兔支气管败血波氏杆菌重组百日咳杆菌粘附素（PRN）蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的表达支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）PRN蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌prn基因序列（AY376325）设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pGEX-4T-1中,以E.coli BL21（DE3）为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白PRN作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等,建立检测支气管败血波氏杆菌抗体的间接ELISA方法。结果成功克隆了prn全基因序列,并在E.coliBL21（DE3）中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白PRN具有良好的抗原性。应用重组蛋白PRN为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白PRN抗原的包被浓度为500ng/mL,最适血清稀释度为1∶40。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。     

中国兰科二新记录种

报道了中国西藏兰科植物二新记录种:无叶沼兰(Crepidium aphyllum(King&Pantl.)A.N.Rao)和矮生白点兰Thrixspermum pygmaeum(King&Pantl.)Holttum。无叶沼兰和本属另一腐生种C.saprophytum(King&Pantl.)A.N.Rao的主要区别为假鳞茎圆柱形,唇瓣平展,顶端圆形,中萼片直立。矮生白点兰与T.masciflorum A.S.Rao&J.Joseph相似,但本种花序短于叶,苞片螺旋排列、花瓣匙形、唇瓣下凹且3裂、中裂片顶端下凹、胼胝体有毛。     

内耳形态学和生理指标对缺铁性肾虚耳聋大鼠模型的评价作用

目的探讨耳蜗显微结构和生理指标对缺铁性肾虚耳聋大鼠模型的评价作用。方法选用体重30～32 g、无耳疾、听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)阈值正常的1～2周龄SPF级SD大鼠120只,雌雄分养,分为缺铁组80只、正常对照组40只,饲养时间12周;以出现肾虚证和至少一耳ABR阈值≥15 dB,作为判断肾虚耳聋的标准,获得缺铁性肾虚耳聋大鼠22只,从中选取肾虚耳聋大鼠20只,同时以20只正常大鼠作对照。观察耳蜗血管纹、螺旋器等耳蜗显微结构变化,检测ABR阈值以及血红蛋白和血清铁等指标的变化。结果实验组和正常对照大鼠的血红蛋白和血清铁分别为11.80 g/L,4.5μmol/L和45.9 g/L,22.23μmol/L,ABR阈值分别为(30±5)dB和(10±5)dB;实验组血管纹血管明显减少;螺旋器毛细胞听毛有缺失、倒伏现象。结论缺铁性肾虚耳聋大鼠血红蛋白、血清铁和ABR阈值,以及耳蜗血管纹、螺旋器等耳蜗显微结构变化等指标,均较为稳定,是较好的评价指标。     

兔附件扭转模型的建立及其意义探讨

目的 建立一种操作简单、病变典型、稳定性好的兔在体附件扭转模型并探讨保留卵巢术后卵巢的病理变化和iNOS的改变.方法 40只日本大耳白兔采用随机数字法分为附件扭转(adnexal torsion,AT)模型组(n=32)和对照组(n=8).模型组兔将左侧附件按顺时针方向扭转3周,避开血管,以4/0丝线横穿扭转形成的3个螺旋圈后固定于左侧腹壁,然后再将之分成4组,每组8只,分别于扭转24、48、72、96h后解除扭转后取双侧卵巢;对照组假手术后96h后取双侧卵巢.所有切除之右侧卵巢组织行病理学研究的内对照,左侧卵巢取1/2行病理检测,另1/2行iNOS生化水平检测.结果 左侧附件扭转3周固定左侧腹壁24 h后可见卵巢充血、炎细胞浸润、细胞水肿;48h见较多的炎细胞浸润,细胞结构紊乱;72 h见大量炎细胞浸润,结构损坏和局灶性坏死;96 h见弥漫性细胞坏死;卵巢组织病理评分呈现相同的时相性变化.各组iNOS生化检测水平(左侧vs.右侧),AT组[24 h(3.542±0.987) vs.(1.521±0.214) U/mgprot,P＜0.01;48 h(4.986±1.321) vs.(1.832±0.321) U/mgprot,P＜0.01;72 h(7.991±1.832) vs.(1.124±0.357)U/mgprot,P＜0.01;96 h(6.991±1.227) vs.(1.732±0.572)U/mgprot,P＜0.01].且AT组卵巢均有iNOS不同程度表达,72 h组表达达高峰,96 h下降.结论 成功地制备兔附件扭转模型,方法简单、病变典型、重复性好,可模拟女性附件扭转的病理生理过程,对进一步研究附件扭转具有重要意义.初步认为附件扭转72h后卵巢发生不可逆改变,是临床处理附件扭转并保留卵巢的时间临界点.