DETERMINING THE LABELING INDEX IN AUTORADIOGRAPHY

A method is proposed for estimating the labeling index in autoradiographs. It is based on a model for the frequency distribution of grain counts for those cells which have few grains. The method does not require extensive grain counting and provides reasonable estimates even when the background level is high. It is particularly suited for experiments where tumor cells, labeled in vivo, are, autoradiographed after being cultured in vitro.     

Intrinsic fluorescence of elongation factor Tu in its complexes with GDP and elongation factor Ts

The intrinsic fluorescence properties of elongation factor Tu (EF-Tu) in its complexes with GDP and elongation factor Ts (EF-Ts) have been investigated. The emission spectra for both complexes are dominated by the tyrosine contribution upon excitation at 280 nm whereas excitation at 300 nm leads to exclusive emission from the single tryptophan residue (Trp-184) of EF-Tu. The fluorescence lifetime of this tryptophan residue in both complexes was investigated by using a multifrequency phase fluorometer which achieves a broad range of modulation frequencies utilizing the harmonic content of a mode-locked laser. These results indicated a heterogeneous emission with major components near 4.8 ns for both complexes. Quenching experiments on both complexes indicated limited accessibility of the tryptophan residue to acrylamide and virtually no accessibility to iodide ion. The quenching patterns exhibited by EF-Tu-GDP and EF-Tu X EF-Ts were, however, different; both quenchers were more efficient at quenching the emission from the EF-Tu x EF-Ts complex. Steady-state and dynamic polarization measurements revealed limited local mobility for the tryptophan in the EF-Tu x GDP complex whereas formation of the EF-Tu x EF-Ts complex led to a dramatic increase in this local mobility.     

Quantal sarcomere-length changes in relaxed single myofibrils.

We carried out experiments on single isolated myofibrils in which thin filaments had been functionally removed, leaving the connecting (titin) filaments as the sole agent taking up the length change. With technical advances that gave sub-nanometer detectability we examined the time course of single sarcomere-length change when the myofibril was ramp-released or ramp-stretched by a motor. The sarcomere-length change was stepwise. Step sizes followed a consistent pattern: the smallest was approximately 2.3 nm, and others were integer multiples of that value. The approximately 2.3-nm step quantum is the smallest consistent biomechanical event ever demonstrated. Although the length change must involve the connecting filament, the size of the quantum is an order of magnitude smaller than anticipated from folding of Ig- or fibronectin-like domains, implying either that folding occurs in sub-domain units or that other mechanisms are involved.     

Phospholipid oxidation catalyzed by cytochrome c in liposomes

Oxidation of liposome phospholipids has been studied in the presence of cytochrome c. Sonicated vesicles of soya bean or egg-yolk lipids, or purified phospholipid preparations, were treated with oxidized cytochrome c at a 10:4 lipid/protein ratio (w/w). Lipid peroxidation was examined by oxygen polarography, gas-liquid chromatography (GLC) and the thiobarbituric acid test. Oxidized, but not reduced, cytochrome effectively catalyzes lipid oxidation under these conditions. Oxygen consumption and disappearance of unsaturated fatty acids follow closely similar patterns, the O2 consumption rate showing a maximum (1.53 mol O2/min per mol heme) shortly before fatty acid loss reaches its peak. GLC and O2 consumption data suggest that monohydroperoxides are the most abundant oxidized species in the system. The thiobarbituric acid reaction, however, appears only to be of qualitative value in peroxidation studies. In order to test the mechanism through which oxidation occurs in our system, the effect of liposome composition and the presence of antioxidants was tested, both on cytochrome c binding to bilayers and on O2 consumption. Oxidized and reduced cytochrome c bind the lipid bilayers with similar affinity, but only the oxidized form is active in autoxidation. Antioxidants do not modify either cytochrome c binding to sonicated liposomes. Lipid composition does influence considerably cytochrome binding, and O2 consumption is correspondingly altered. Studies with various antioxidants and inhibitors suggest that both free radicals and singlet oxygen may be involved in the process under study.     

NMR studies of the conformational change in human N-p21ras produced by replacement of bound GDP with the GTP analog GTP gamma S.

1H-Detected 15N-edited NMR in solution was used to study the conformational differences between the GDP- and GTP gamma S-bound forms of human N-p21ras. The amide protons of 15N-labeled glycine and isoleucine were observed. Resonances were assigned to residues of particular interest, glycines-60 and -75 and isoleucines-21 and -36, by incorporating various 13C-labeled amino acids in addition to [15N]glycine and [15N]iosleucine and by replacing Mg2+ by Co2+. When GTP gamma S replaced GDP in the active site of p21ras, only 5 of the 14 glycine amide resonances show major shifts, indicating that the conformational effects are fairly localized. Responsive glycines-10, -12, -13, and -15 are in the active site. Gly-75, located at the far end of a conformationally-active loop and helix, also responds to substitution of GTP gamma S for GDP, while Gly-77 does not, supporting a role for Gly-75 as a swivel point for the conformational change. The amide proton resonances of isoleucines-36 and -21 and a third unidentified isoleucine also undergo major shifts upon replacement of GDP by GTP gamma S. Thus, the effector-binding loop containing Ile-36 is confirmed to be involved in the conformational change, and the alpha-helix containing Ile-21 is also shown to be affected.     

Zum Brutparasitismus vonTapera naevia

Ohne Zusammenfassung     

Die Wirkung des konstanten galvanischen Stromes auf das Zentralnervensystem des Regenwurmes

Zusammenfassung Moore hat bei galvanischer Längsdurchströmung von Regenwürmern gefunden, daß bei absteigender Stromrichtung Verkürzung, dagegen bei aufsteigender Verlängerung des Wurmes eintritt. Nachdem diese Reaktion des Tieres je nach der Stromrichtung nach Ausschneiden des Bauchmarkes verschwand, kann der galvanische Strom nicht an den Muskeln selbst, sondern nur am Zentralnervensystem angreifen. Die Erscheinungen bei galvanischer Längsdurchströmung würden daher besagen, daß es je nach der Stromrichtung nur oder vorzugsweise zur Erregung der Neurone für die Längsmuskeln bzw. der Neurone für die Ringmuskeln kommt. Aufgabe der vorliegenden Untersuchung war es nun, die entgegengerichteten Längenänderungen des Regenwurmes auch graphisch in Kurvenform darzustellen, wobei das eine Ende des Tieres befestigt, das zweite mit einem Schreibhebel verbunden werden sollte. Die Notwendigkeit zu einer solchen Beobachtungstechnik ergab sich einerseits daraus, daß die kurvenmäßige Aufzeichnung von Längenänderungen einen viel klareren Beweis als die subjektiven Beobachtungen am frei beweglichen Tier (Moore) darstellt und andererseits, weil Scheminzky bei solchen Aufzeichnungsversuchen nicht immer die Befunde von Moore erheben konnte. Die hier berichteten Versuche zeigten, daß unter Benützung schwerer Schreibhebel sich tatsächlich die von Moore beschriebenen Reaktionen nicht immer einstellen. Wird jedoch ein äuerst leichter Schreibhebel verwendet, so ergibt auch die graphische Aufzeichnung der Längenänderungen in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle eine Reaktion, wie sie Moore auch am frei beweglichen, nicht befestigten Tier beobachtet hat. Es konnte schließlich auch bestätigt werden, daß mit Entfernung des Bauchmarkes die Reaktionen auf Durchströmung mit konstantem galvanischen Strom verschwinden. Die Durchsicht des Schrifttums hat im übrigen auch gezeigt, daß ganz ähnliche Längenänderungen von anderen Forschern auch schon bei anderen Würmern beschrieben worden sind.Wenn nun der absteigende galvanische Strom die Neurone für die Längsmuskeln, der aufsteigende galvanische Strom die Neurone für die Ringmuskeln erregt, so muß man mit Moore annehmen, daß die genannten Neurone im Bauchmark des Regenwurmes verschieden ausgerichtet und mit ihren Axonpolen in entgegengesetzte Richtung gestellt sind; ob dies tatsächlich zutrifft, sollen bereits im Gange befindliche Untersuchungen erweisen. Jedenfalls zeigt die entgegengesetzt gerichtete Funktionsbeeinflussung des Zentralnervensystems je nach der Stromrichtung, daß auch das Bauchmark des Regenwurmes eine funktioneile Polarität im Sinne von Scheminzky besitzt.Bemerkenswert ist, daß bei einzelnen Tieren — so wie es Scheminzky schon früher beobachtet hat — genau verkehrte Reaktionen auf die Durchströmung wie bei Moore vorkommen können: Verlängerung im absteigenden, Verkürzung im aufsteigenden Strom; dies zeigt, daß die funktioneile Polarität im Zentralnervensystem des Regenwurmes von vornherein nicht festgelegt zu sein braucht, sondern sich einmal so, einmal anders auswirken kann. Vor allem wurde die Umkehr jener Reaktion, wie sie von Moore beschrieben und in der Mehrzahl der von mir durchgeführten Versuche beobachtet wurde, bei Anwendung des schweren Schreibhebels gefunden, unter Bedingungen also, bei denen der Wurmkörper eine gewisse Vordehnung durch die Belastung erlitt. Es darf daher angenommen werden, daß dabei das v. Uexküllsche Gesetz über das Abfließen zentraler Erregungen vorwiegend nach den gedehnten Muskeln hin eine Rolle spielt.