Isolation and properties of the plasmalemma in yeast

Summary A method is described for the isolation of fragments of the plasmalemma based on differential and density gradient centrifugation using cell free extracts from anaerobically grown Saccharomyces cerevisiae. Electron microscopically investigated frozen-etched specimens of isolated plasmalemma revealed the presence of globular particles attached to the outer surface of the membrane; these particles correspond to those observed in situ.In isolated plasmalemma a high specific activity of Mg⁺⁺-dependent ATPase, which is not sensitive to Oligomycin, is present. Yeast plasmalemma contains protein, lipids (including phospholipids) and an appreciable amount of polysaccharide. Hydrolysis of this polysacharide yields only mannose.The treatment of the isolated plasmalemma with detergents liberates the globular particles which can be isolated by density gradient centrifugation. Protein and polysaccharide occur in the respective fraction; therefore the globular particle represents a mannan-protein. It is concluded that the particles, which cover the plasma-membrane of plant cells, represent glycoproteins, that is, building stones to be incorporated into the fibrillar network of the cell walls.     

Lipoide als zytochemisches Substrat der Bindungsorte basischer Vitalfarbstoffe in Blut-, Epithel- und Tumorzellen

Zusammenfassung Die zytochemische Natur der Anreicherungsorte basischer Vitalfarbstoffe (Akridinorange, Nilblausulfat und Neutralrot) im Zytoplasma von Blutplättchen, Leukozyten, Mäuseaszites-Tumorzellen und Epithelzellen wurde untersucht. Dabei stellte sich heraus, daß bei allen untersuchten Zelltypen Phospholipoide oder Phospholipoproteide als Substrat der umschriebenen Farbstoffbindung in lysosomalen Zellstrukturen dienen. Die Supravitalfärbung mit basischen Farbstoffen ist demnach als zytochemischer Lipoidnachweis geeignet, wenn unter bestimmten Bedingungen und unter Einhaltung eines definierten Färbestadiums (Stadium der granulären oder vakuolären Farbstoffverteilung) beobachtet wird. Auf die methodischen Vorteile der Supravitalfärbung wird hingewiesen.

---

Summary The cytochemical character of the substrat for basic vital dyes (acridine orange, nil blue sulfate, neutral red) has been studied in the cytoplasma of blood platelets, leucocytes, Ehrlich Ascites tumor cells and epithelial cells. It could be demonstrated that the vital dyes are bound to lysosomal phospholipids or phospholipoproteins in the different cell types. Supravital staining with basic dyes is therefore considered to be a useful method for identifying lipid material in cytology, provided defined conditions and stades of staining are observed. The advantages of the proposed method are discussed.

---

---

Stipendiat der Deutschen Forschungsgemeinschaft     

Der cytochemische Nachweis von Prolin-Dehydrogenasen,Acetaldehyd-Dehydrogenasen und Dihydroliponsäure-Dehydrogenase in den Zellen vonSaccharomyces cerevisiae

Summary Using the tetrazolium salt Nitro-BT, the following dehydrogenases can be demonstrated cytochemically in the cells ofSaccharomyces cerevisiae: (1)Proline dehydrogenase activity: it cannot be decided whether the formazan production is a result of L-proline: NAD(P)-2-oxidoreductase (E.C. 1.5.1.1) or of L-proline:NAD(P)-5-oxidoreductase(E.C. 1.5.1.2); (2)Aldehyde dehydrogenase activity: using the coenzymes NAD and NADP and the activators KCl and MgCl₂, different reaction pictures are obtained which led to the conclusion that aldehyde: NADP oxidoreductase (E.C. 1.2.1.4) and aldehyde: NAD(P) oxidoreductase (E.C. 1.2.1 5) can be demonstrated seperately; (3)Dihydrolipoic dehydrogenase (E.C. 1.6.4.3): an exactly controlled pH level (pH 6.0) of the complete incubation medium is an essential prerequisite for the specificity of the reaction. The formation of filamentous formazan deposits can be interpreted as the expression of the mitochondrial localization of the enzyme.Zusammenfassung In den Zellen vonSaccharomyces cerevisiae lassen sich mit Hilfe des Tetrazoliumsalzes Nitro-BT cytochemisch nachweisen: 1. eineProlin-Dehydrogenasen-Aktivität, wobei nicht entschieden werden kann, ob die Formazanbildung durch L-Prolin: NAD(P)-2-Oxydoreduktase(E.C. 1.5.1.1) oder durch L-Prolin: NAD(P)-5-Oxydoreduktase(E.C. 1.5.1.2) hervorgerufen wird; 2. eineAldehyd-Dehydrogenasen-Aktivität: durch Einsatz der Coenzyme NAD und NADP sowie der Aktivatoren KCl und MgCl₂ erhält man unterschiedliche Reaktionsbilder, so daß die Annahme gerechtfertigt erscheint, daß hiermit Aldehyd: NADP-Oxydoreduktase(E.C. 1.2.1.4) und Aldehyd: NAD(P)-Oxydoreduktase (E.C. 1.2.1.5) getrennt nachweisbar sind; 3. dieDihydroliponsäure-Dehydrogenase (NAD-H₂:Lipoamid-Oxydoreduktase, E.C. 1.6.4.3): bei diesem Enzymnachweis ist eine exakte Einstellung des pH-Wertes des Mediums auf 6,0 die Voraussetzung für die Spezifität. Die Bildung länglicher Formazanablagerungen in den meisten Zellen deutet auf die mitochondriale Lokalisation des Enzyms hin.

---

---

Frau Prof. Dr. B.Haccius danke ich für die großzügige Unterstützung bei der Durchführung dieser Untersuchungen. Die Brotfabrik Grahamhaus Studt KG., Bad Kreuznach, stellte einen Arbeitsplatz zur Verfügung, wofür ich auch an dieser Stelle danken möchte.     

Die Histotopik einiger Oxydoreduktasen im Hoden von Hund und Katze

Zusammenfassung Im Hoden von Hund und Katze werden folgende Enzyme histochemisch nachgewiesen: NADH-Tetrazoliumreduktase (NADH-T-Red), NADPH-Tetrazoliumreduktase (NADPH-T-Red), Cytochromoxydase (Cyt-Ox), Lactat-Dehydrogenase (LDH), Aldolase (ALD), Alkohol-Dehydrogenase (ADH), Glycerin-1-phosphat-Dehydrogenase (GDH), Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G-6-PDH), Succinat-Dehydrogenase (SDH), NAD-spezifische Isocitrat-Dehydrogenase (NAD-ICDH). Die starke Fermentaktivität der G-6-PDH und der LDH in den Leydig-Zellen beider Spezies, der relativ hohe Gehalt an histochemisch nachweisbarer ADH in den Zwischenzellen der Katze sowie eine deutliche Reaktion auf GDH in den Sertoli-Zellen der Katze werden diskutiert.

---

Summary In the testes of dog and cat the distribution pattern of NADH-tetrazolium reductase, NADPH-tetrazolium reductase, cytochrome oxydase, lactate dehydrogenase, aldolase, alcohol dehydrogenase, -glycerophosphate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, succinate dehydrogenase and NAD specific isocitrate dehydrogenase was studied by histochemical means. The strong reaction of G-6-PDH and LDH in the Leydig cells of both species, the relatively high amount of ADH in the interstitial cells of the cat testis and the principal site of -GPDH in the Sertoli cells of the cat are discussed.

     

Der cytochemische Nachweis von Cytochromoxydase und Peroxydasen bei Pilzen

Zusammenfassung Verschiedene Nachweisverfahren für Cytochromoxydase und Peroxydase wurden an den Pilzen Neurospora crassa, Oospora lactis und Saccharomyces cerevisiae getestet und die jeweils beste zur Zeit verfügbare Methode ermittelt.Zur cytochemischen Lokalisation der Cytochromoxydase (E.C. 1.9.3.1) ist das Amin-Amin-Verfahren von Burstone (1960) mit den Reaktionspartnern p-Aminodiphenylamin und Variaminblau B (p-Methoxy-p-aminodiphenylamin) zu empfehlen, wobei die optimale Inkubationszeit bei allen Pilzen 30 min beträgt. Die braunroten Reaktionsprodukte sind im Cytoplasma aller Pilze gleichmäßig verteilt. Eine Nachbehandlung der Präparate in Cobaltacetat-Lösung (Burstone, 1960) sowie die Zwischenschaltung einer Behandlung mit Lugolscher Lösung (Butcher u. Mitarb., 1964) verbesserten das Reaktionsbild nur unwesentlich. Eine in vitro und in vivo nachgewiesene geringe Fettlöslichkeit des Reaktionsproduktes erlaubt keine exakte Lokalisation der Enzymaktivität. Kontrolluntersuchungen bestätigen die Spezifität der Nachweisreaktion.Bei Einsatz von Aminen, Phenolen und der Zink-Leuko-Methode zum Nachweis der Peroxydase erwies sich lediglich 3-Amino-9-äthylcarbazol (Graham u. Mitarb., 1965) als brauchbar. Nach der optimalen Inkubationszeit von 60 min enthalten alle Zellen distinkte, kleine, runde Granula, die im Cytoplasma gleichmäßig verteilt sind. Auch hier erschwert eine gewisse Fettlöslichkeit des Reaktionsproduktes eine exakte intrazelluläre Enzymlokalisation. Da N. crassa und S. cerevisiae gleichzeitig eine Peroxydase (E.C. 1.11.1.7) und eine Cytochrom c-Peroxydase (E.C. 1.11.1.5) besitzen, kann nicht gesagt werden, ob nur eines der beiden Enzyme oder ob beide gleichzeitig mit vorliegender Methode nachgewiesen werden.

---

Summary Different methods for the detection of cytochrome oxidase and peroxidase were tested in the fungi Neurospora crassa, Oospora lactis and Saccharomyces cerevisiae in order to find out the best technique.The two-amine-method of Burstone (1960) (p-aminodiphenylamine + p-methoxy-p-aminodiphenylamine) is recommended for the localization of cytochrome oxidase (E.C. 1.9.3.1) whereby the optimal incubation period in all fungi is 30 minutes. The reaction products are always round-shaped and equally distributed in the cytoplasm. A postincubation of the preparations in a cobalt acetate solution (Burstone, 1960) or a treatment in Lugol's iodine (Butcher et al., 1964) give no remarkably better results. A low solubility of the reaction product in lipid substances, as detected in vitro and in vivo, however does not allow any exact intracellular localization of the enzyme activity.Testing amines, phenols and the zinc-leuco method for the detection of peroxidase, only the method of Graham et al. (1965) proves to be useful. After an optimal incubation period of 60 minutes all cells show distinct, small, round-shaped deposits that are equally distributed throughout the cytoplasm of all fungi. A certain lipid solubility of the reaction product makes an exact enzyme localization difficult. As N. crassa and S. cerevisiae simultaneously possess a normal peroxidase (E.C. 1.11.1.7) and a cytochrome c-peroxidase (E.C. 1.11.1.5) it cannot be decided whether the technique evaluates only one enzyme or both types of peroxidase.

---

---

Frau Prof. Dr. B. Haccius danke ich für die Anregung zu diesen Untersuchungen sowie für die stete Unterstützung und Anteilnahme am Fortgang der Arbeit. Der Firma Grahamhaus Studt KG, Bad Kreuznach, bin ich für die großzügige Bereitstellung eines Arbeitsplatzes zu Dank verpflichtet.     

Structure of the pineal organ of the sardine,Sardina pilchardus sardina (Risso), and some further remarks on the pineal organ of Mugil spp.

Summary The pineal organ of the sardine, Sardina pilchardus sardina, was investigated light and electron microscopically. The pineal parenchyma contains sensory cells, supporting cells, and ganglion cells, and the overlying tissues appear specialized for light penetration. The ganglion cells are arranged in 3 groups, their axons giving rise to the tractus epiphyseos. The sensory cell is of a photoreceptor type found in several other teleost species. No definitive evidence of a secretion was educed but some indications of an endocrine function are reported and discussed.The pineal receptor cell of neonates of Mugil spp. which have a pigment-free spot above the pineal organ, was investigated electron microscopically and found to have the same organization as that of adult Mugil auratus.Supported by grants from the Helge Ax:son Johnsons Stiftelse, Stockholm, and from the Kungliga Vetenskapsakademien, Stockholm, Sweden. This is gratefully acknowledged.The animal material has been provided by the Stazione Zoologica di Napoli.     

Elektronenmikroskopische Untersuchungen an den Hüllen der Oozyten und Eier des Flussbarsches Perca fluviatilis

Zusammenfassung Die Hüllen von Oozyten und reifen Eiern des Fußbarsches wurden licht- und elektronenmikroskopisch untersucht. In Oozyten vor der Bildung der Zona radiata sind die meisten der keulenförmigen Mikrovilli gerade auf die Follikelzellen ausgerichtet. Gelegentlich verlaufen Mikrovilli auch parallel zur Oozytenoberfläche. Die Zona radiata reiferer Eizellen besteht aus zwei Schichten, der elektronendichten Zona radiata externa und der weniger dichten Zona radiata interna. Während die erstere aus einem hochorganisierten Material besteht, ist die letztere aus einer Substanz von geringerer Dichte zusammengesetzt. In der Matrix der Zona radiata interna liegen unregelmäßig angeordnete flaschenbürstenähnliche Einschlüsse. Nach Kontrastierung mit l%iger Phosphorwolframsäure und 0,5% igem Uranylazetat sind feine Fibrillen in der Matrix nachweisbar. Die Zona radiata externa ist außen von einer Gallerthülle umgeben. Sie ist etwa fünfmal so stark wie die gesamte Zona, radiata. Diese Gallerthülle besteht aus homogenem Material von geringerer Dichte. Nach Anfärbung mit 0,2%-igem Rutheniumrot färbt sich diese Schicht intensiv rot. Daraus läßt sich auf das Vorhandensein von sauren Mukopolysacchariden schließen. In der Gallerthülle liegen elektronendichte Körnchen, in denen sich bei hoher Auflösung eine hochorganisierte, kristalloide Struktur nachweisen läßt. Die Gallerthülle wird von den zytoplasmatischen Fortsätzen der kegelförmigen Follikelzellen durchdrungen. Diese Fortsätze gehen in Ausläufer über, die in die Porenkanäle der Zona radiata eindringen. In einigen Fällen umhüllen die Ausläufer der Follikelzellen die Mikrovilli der Oozyte vollständig. Normalerweise liegen die Mikrovilli und die Ausläufer aber deutlich voneinander getrennt. Die Mikrovilli enden entweder direkt an der Zellmembran der Follikelzellen oder sie dringen tief in Membraneinstülpungen ein. Mikrovilli und die Ausläufer der Follikelzellen befinden sich in den Porenkanälen fast reifer Eier. Kurz vor der Ovulation werden sie wahrscheinlich zurückgezogen. Die Porenkanäle reifer Barscheier sind im äußeren Drittel der Zona radiata interna verschlossen.

---

Summary The envelope of oocytes and mature eggs of the perch was examined by light and electron microscope. In oocytes before the formation of the zona radiata most of the clubshaped microvilli project straightly towards the follicular cells. Some, however, run parallel to the oocyte surface. The zona radiata of more mature oocytes consists of the electron dense zona radiata externa and the less electron dense zona radiata interna. While the former consists of a highly organized material, the latter is composed of a substance of low density, with the exception of a few brush-shaped inclusions which are scattered irregularely within the matrix of the zona radiata interna. After treatment with 1% phosphotungstic acid and 0.5% uranyl acetate tiny fibres become visible. External to the zona radiata externa the oocytes are enveloped by a jelly layer, about five times as thick as the zona radiata. The jelly layer appears to consist of a rather homogeneous material of low density. After treatment with a solution of 0,2% ruthenium red the jelly layer is stained intensely red, suggesting the presence of acidic mucopolysaccharides. Within the matrix of the jelly layer are embedded electron dense granules of unknown function. At high resolution they reveal a well organized, crystalloid structure. The jelly layer is penetrated by cytoplasmic processes of the cone-shaped follicular cells. These processes develop extensions which enter the pore canals of the zona radiata. In some cases these extensions envelope the microvilli of the oocytes completely. But normally the microvilli and the extensions are clearly separated. The microvilli make either direct contact with the membrane of the follicular processes or penetrate deeply into membrane interdigitations. Microvilli together with follicular extensions are present in the pore canals of almost mature eggs. They seem to be withdrawn just before ovulation. The pore canals of the zona radiata are partly closed in mature eggs.

---

---

Ich verdanke die Anregung zu dieser Arbeit einer Diskussion, die ich mit Herrn Prof. Dr. E. A. Arndt, Rostock, anläßlich seines Vortrages am 21. Februar 1966 in Kiel führte.

---

Untersuchungen mit Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft. Herrn Prof. Dr. O. Moritz, Institut für Pharmakognosie, danke ich für die Möglichkeit, das Elektronenmikroskop seines Institutes zu benutzen. Frau R. Bardenhewer, geb. Schmidtke, danke ich für die Hilfe bei der Präparation und für die Anfertigung der photographischen Vergrößerungen.     

Sphaeridien mit kristalloiden Einschlüssen in den Zellkernen der Katzenmilz

Zusammenfassung In verschiedenen Organen der Katze sind regelmäßig Karyoplasmadifferenzierungen vom Typ der granulären Sphaeridien mit einem filamentösen Externum und einem granulären Internum zu beobachten. In den Zellen des lymphatischen Systems weist ein Teil dieser Sphaeridien ca. 0,3 große, nur wenig elektronendichte Einschlüsse mit kristalloider Struktur auf. Es wird angenommen, daß es sich dabei um Protein handelt, das im Kern synthetisiert wird.

---

Summary In the caryoplasm of various organs of the cat structures of the type of granular sphaeridies are regularly observed, which consist of a filamentous externum and a granular internum. In the cells of the lymphatic system in many of these sphaeridies inclusions of rather electronlucent material are found, which are arranged in a crystal-like pattern. It is suggested that these inclusions of the sphaeridies are composed of protein, which is produced in the nucleus.