Long Term Ablation of Protein Kinase A (PKA)-mediated Cardiac Troponin I Phosphorylation Leads to Excitation-Contraction Uncoupling and Diastolic Dysfunction in a Knock-in Mouse Model of Hypertrophic Cardiomyopathy

The cardiac troponin I (cTnI) R21C (cTnI-R21C) mutation has been linked to hypertrophic cardiomyopathy and renders cTnI incapable of phosphorylation by PKA in vivo. Echocardiographic imaging of homozygous knock-in mice expressing the cTnI-R21C mutation shows that they develop hypertrophy after 12 months of age and have abnormal diastolic function that is characterized by longer filling times and impaired relaxation. Electrocardiographic analyses show that older R21C mice have elevated heart rates and reduced cardiovagal tone. Cardiac myocytes isolated from older R21C mice demonstrate that in the presence of isoproterenol, significant delays in Ca²⁺ decay and sarcomere relaxation occur that are not present at 6 months of age. Although isoproterenol and stepwise increases in stimulation frequency accelerate Ca²⁺-transient and sarcomere shortening kinetics in R21C myocytes from older mice, they are unable to attain the corresponding WT values. When R21C myocytes from older mice are treated with isoproterenol, evidence of excitation-contraction uncoupling is indicated by an elevation in diastolic calcium that is frequency-dissociated and not coupled to shorter diastolic sarcomere lengths. Myocytes from older mice have smaller Ca²⁺ transient amplitudes (2.3-fold) that are associated with reductions (2.9-fold) in sarcoplasmic reticulum Ca²⁺ content. This abnormal Ca²⁺ handling within the cell may be attributed to a reduction (2.4-fold) in calsequestrin expression in conjunction with an up-regulation (1.5-fold) of Na⁺-Ca²⁺ exchanger. Incubation of permeabilized cardiac fibers from R21C mice with PKA confirmed that the mutation prevents facilitation of mechanical relaxation. Altogether, these results indicate that the inability to enhance myofilament relaxation through cTnI phosphorylation predisposes the heart to abnormal diastolic function, reduced accessibility of cardiac reserves, dysautonomia, and hypertrophy.     

The effect of patch isolation on reproductive synchrony in the root vole

Both social and environmental cues can synchronise breeding, but are likely to operate at different spatial and temporal scales. Here we test if breeding is synchronised at the patch or the population level in experimental patchy populations of root voles. We found no overall synchronisation neither at the patch nor at the population level. However, at the patch level, breeding was synchronised within patches if the patches were isolated and thus had little exchange of animals with other patches. In accordance with what has been predicted for matrilineally structured populations, we conclude that breeding synchrony is facilitated when social cues are exchanged within stable female groups.     

Cloning of the glutamine synthetase gene fromspirulina platensis

An 8 Kilobase-pair (Kbp) HindIII fragment containing the coding sequence forSpirulina platensis glutamine synthetase [EC 6.3.1.1.] has been identified utilizing a probe derived fromAnabaena 7120 and cloned in the vector pAT153.     

On-line coupling of automated solid-phase extraction with high-performance liquid chromatography and electrochemical detection: Quantitation of oxidizable drugs of abuse and their metabolites in plasma and urine

The concentration effect of automated on-line solid-phase extraction (SPE) in combination with HPLC and very sensitive electrochemical detection was employed for the determination of N-ethyl-4-hydroxy-3-methoxy-amphetamine (HMEA, the main metabolite of the ecstasy analogue MDE), Δ⁹-tetrahydrocannabinol (THC) and 11-nor-Δ⁹-tetrahydrocannabinol-carboxylic acid (THC-COOH) in plasma and urine in comparison to a previously published psilocin assay. For the SPE either CBA (functional group: carboxypropyl)- or CH (functional group: cyclohexyl)-sorbent was used. The following separation was carried out on a reversed-phase column (LiChroCart, Superspher 60 RP select B from Merck). Depending on the hydrodynamic voltammogram of the analyzed substance the oxidation potential varied from 920 mV up to 1.2 V. In spite of using high potentials, precision and accuracy were always within the accepted statistical requirements. The limits of quantitation were between 5 ng/ml (THC, THC-COOH in plasma) and 20 ng/ml (HMEA in plasma). Advantages of on-line SPE in comparison with off-line methods were less manual effort, evidently smaller volumes (≤400 μl) of plasma or urine and almost always higher recovery rates (>93%). The assays have been successfully proven with real biological samples and found suitable for use in routine analysis.     

A demographic analysis of vole population responses to fragmentation and destruction of habitat

 Fragmentation and destruction of natural habitats is currently considered to be the major threat to wildlife populations. We here perform a comprehensive analysis of the demographic effects of habitat fragmentation and destruction on 14 populations of the root vole. The experiment was divided into two consecutive periods. During the first period, we contrasted populations with the same initial size and structure in continuous and fragmented habitat. During the second period, we fragmented the continuous habitat into the same configuration as the permanently fragmented habitat so that the effect of habitat destruction could be evaluated. We estimated survival and fecundity parameters and combined them into population projection matrices to evaluate their relative impact on population growth. In the first period of the experiment there was no difference in population growth rate between fragmented and continuous populations, although litter size was significantly higher in the continuous populations. In the second period, we found higher population growth rates in populations that had experienced habitat destruction. By applying the transition matrix model to empirical estimates of demographic parameters, we demonstrate that the difference in population growth rate in the second period of the experiment was the result of a nonsignificant difference in adult survival. Movements out of the habitat patches were significantly lower in populations that had experienced habitat destruction. We conclude that predator-caused mortality of animals moving out of the habitat patches was the main determinant of demographic variation in this system. Received: January 31, 2002 / Accepted: March 25, 2003     

Nervöse Überträgersubstanzen und ihr fermentativer Abbau

Zusammenfassung In sensiblen Nerven der Wirbeltiere kommen zwei Überträger substanzen vor, Dorsin in den dorsalen Rückenmarkswurzeln, Opticin im Nervus opticus und im Nervus stato-acusticus; von beiden ist es möglich, daß sie auch im Zentralnervensystem vorkommen. Beide sind im Bienentest durch Kreise nach der Seite des angestochenen Auges nachweisbar, im Test am denervierten Kaninchenohr wirkt Dorsin schon wenige Tage nach der Nervendurchschneidung gut, Opticin wirkt in den ersten 2–3 Wochen sehr schwach und erst nach der 4. Woche, evtl. nach einer zweiten Nervendurchschneidung, gut.Durch Kochen der Nerven in wäßriger Lösung erhält man Dorsin und Opticin in gebundener Form, durch Kochen in 75%igem Alkohol und Überführen in wäßrige Lösung in freier Form.Durchleiten von Sauerstoff durch Lösungen von Überträgersubstanzen zerstört Opticin rascher als Dorsin und jeweils die freie Form rascher als die gebundene. 5-Oxytryptamin, das im Bienentest nach der Seite des nicht angestochenen Auges wirkt, wird durch Sauerstoff in eine Substanz verwandelt, die im Bienentest nach der Seite des angestochenen Auges wirkt.Lösungen von Dorsin vertragen kurzes Kochen, Opticin wird in Lösung schon bei 60° C in mehreren Minuten zerstört, wobei freies Opticin empfindlicher ist als gebundenes.Von den freien Überträgersubstanzen wird jede durch ein eigenes Ferment abgebaut. Die Mengen von Dorsinase, die Dorsin abbaut, in den dorsalen Wurzeln und von Opticinase, die Opticin abbaut, im Nervus opticus sind so, daß sie die Überträgersubstanzen unter vergleichbaren Bedingungen in ähnlichen Zeiten abbauen, wie Cholinesterase aus ventralen Wurzeln Acetylcholin abbaut.Gebundenes Dorsin der Wirbeltiere wird durch Pease gespalten, ein Ferment, das man erhält, wenn man eine stark verdünnte, nicht sterile Aufschwemmung aus zerriebenen dorsalen Wurzeln einen Tag lang bei 36° C inkubiert. Die sehr rasche Wirkung dieses Fermentes läßt sich auch mit dem Test am Meerschweinchen-Ileum an der Abnahme der P-Wirkung eines Extraktes aus dorsalen Wurzeln verfolgen.Gebundenes Opticin und andere gebundene Überträgersubstanzen der Wirbeltiere werden durch Dorsinase gespalten. Dorsinase führt diese Spaltung ähnlich rasch durch wie Pease die Spaltungen von gebundenem Dorsin und etwa 50mal so rasch wie den Abbau von freiem Dorsin.Gebundenes Acetylcholin ist als Überträgersubstanz vom Hornhautepithel auf die freien Nervenenden und von sekundären Sinneszellen auf die sensiblen Nerven anzunehmen.Bei der Nervendegeneration erfahren Opticin und Dorsin ähnliche Veränderungen wie Acetylcholin.Bei Mollusken sind als nervöse Überträgersubstanzen wenigstens Opticin, 5-Oxytryptamin und Acetylcholin anzunehmen, bei Arthropoden wenigstens Dorsin, Opticin, Acetylcholin, 5-Oxytryptamin und eine noch kaum untersuchte Substanz, deren fermentativer Abbau durch Strychnin gehemmt wird, bei Anneliden dieselben Substanzen mit Ausnahme von Dorsin.Die Krämpfe lassen sich durch die Hemmung des fermentativen Abbaues von Überträgersubstanzen durch die Krampfgifte erklären. Bei Mollusken und bei Arthropoden hemmen verschiedene Krampfgifte verschiedene Fermente und damit den Abbau verschiedener Überträgersubstanzen. Bei den Wirbeltieren ist die Hemmung der Dorsinase am wichtigsten. Die typischen Krampfgifte hemmen die Dorsinase in denselben gegenseitigen Verhältnissen, in denen sie Krämpfe auslösen. Die Hemmung der Dorsinase bedeutet eine Hemmung des Abbaues von freiem Dorsin und eine Hemmung der Spaltung anderer gebundener Überträgersubstanzen; damit dürfte auch die Wirkung sekundärer Sinneszellen auf die sensiblen Nerven gesteigert werden. Die bei den verschiedenen Krampfgiften verschieden starke zusätzliche Hemmung der Cholinesterase beeinflußt den Charakter der Krämpfe. Als Erklärung für den spezifischen Charakter der Strychninund Brucinkrämpfe bleibt noch die Blockierung der Hemmungen, die bei Wirbeltieren nur durch diese beiden Krampfgifte erfolgt, oder die Hemmung des fermentativen Abbaues von Crosslands Kleinhirnfaktor.Fräulein Ilse Silberbauer und Herrn Helmut Gübitz danken wir für ihre Mithilfe bei einem Teil der Versuche.Wir danken allen Tierärzten des Grazer Schlachthauses für ihr stets freundliches und verständnisvolles Entgegenkommen, welches sie uns bei dieser Arbeit und schon seit 1946 bei den im Literaturverzeichnis genannten Arbeiten von Hellauer und Umrath gezeigt haben.     

Cell size at S phase initiation: an emergent property of the G1/S network

The eukaryotic cell cycle is the repeated sequence of events that enable the division of a cell into two daughter cells. It is divided into four phases: G₁, S, G₂, and M. Passage through the cell cycle is strictly regulated by a molecular interaction network, which involves the periodic synthesis and destruction of cyclins that bind and activate cyclin-dependent kinases that are present in nonlimiting amounts. Cyclin-dependent kinase inhibitors contribute to cell cycle control. Budding yeast is an established model organism for cell cycle studies, and several mathematical models have been proposed for its cell cycle. An area of major relevance in cell cycle control is the G₁ to S transition. In any given growth condition, it is characterized by the requirement of a specific, critical cell size, P_S, to enter S phase. The molecular basis of this control is still under discussion. The authors report a mathematical model of the G₁ to S network that newly takes into account nucleo/cytoplasmic localization, the role of the cyclin-dependent kinase Sic1 in facilitating nuclear import of its cognate Cdk1-Clb5, Whi5 control, and carbon source regulation of Sic1 and Sic1-containing complexes. The model was implemented by a set of ordinary differential equations that describe the temporal change of the concentration of the involved proteins and protein complexes. The model was tested by simulation in several genetic and nutritional setups and was found to be neatly consistent with experimental data. To estimate P_S, the authors developed a hybrid model including a probabilistic component for firing of DNA replication origins. Sensitivity analysis of P_S provides a novel relevant conclusion: P_S is an emergent property of the G₁ to S network that strongly depends on growth rate.