Kinetics and mechanism of exogenous anion exchange in FeFbpA–NTA: significance of periplasmic anion lability and anion binding activity of ferric binding protein A

The bacterial transferrin ferric binding protein A (FbpA) requires an exogenous anion to facilitate iron sequestration, and subsequently to shuttle the metal across the periplasm to the cytoplasmic membrane. In the diverse conditions of the periplasm, numerous anions are known to be present. Prior in vitro experiments have demonstrated the ability of multiple anions to fulfill the synergistic iron-binding requirement, and the identity of the bound anion has been shown to modulate important physicochemical properties of iron-bound FbpA (FeFbpA). Here we address the kinetics and mechanism of anion exchange for the FeFbpA–nitrilotriacetate (NTA) assembly with several biologically relevant anions (citrate, oxalate, phosphate, and pyrophosphate), with nonphysiologic NTA serving as a representative synergistic anion/chelator. The kinetic data are consistent with an anion-exchange process that occurs in multiple steps, dependent on the identity of both the entering anion and the leaving anion. The exchange mechanism may proceed either as a direct substitution or through an intermediate FeFbpA–X* assembly based on anion (X) identity. Our kinetic results further develop an understanding of exogenous anion lability in the periplasm, as well as address the final step of the iron-free FbpA (apo-FbpA)/Fe³⁺ sequestration mechanism. Our results highlight the kinetic significance of the FbpA anion binding site, demonstrating a correlation between apo-FbpA/anion affinity and the FeFbpA rate of anion exchange, further supporting the requirement of an exogenous anion to complete tight sequestration of iron by FbpA, and developing a mechanism for anion exchange within FeFbpA that is dependent on the identity of both the entering anion and the leaving anion.     

Cationic oligopeptides with the repeating sequence L‐lysyl‐L‐alanyl‐L‐alanine: conformational and thermal stability study using optical spectroscopic methods

The infrared (IR), vibrational circular dichroism (VCD), and electronic circular dichroism (ECD) spectra of short cationic sequential peptides (L ‐Lys‐L ‐Ala‐L ‐Ala)_n (n = 1, 2, and 3) were measured over a range of temperatures (20–90 °C) in aqueous solution at near‐neutral pH values in order to investigate their solution conformations and thermally induced conformational changes. VCD spectra of all three oligopeptides measured in the amide I′ region indicate the presence of extended helical polyproline II (PPII)‐like conformation at room temperature. UV‐ECD spectra confirmed this conclusion. Thus, the oligopeptides adopt a PPII‐like conformation, independent of the length of the peptide chain. However, the optimized dihedral angles ? and ψ are within the range ?82 to ?107° and 143–154°, respectively, and differ from the canonical PPII values. At elevated temperatures, the observed intensity and bandshape variations in the VCD and ECD spectra show that the PPII‐like conformation of the Lys‐Ala‐Ala sequence is still preferred, being in equilibrium with an unordered conformer at near‐neutral pH values within the range of temperatures from 20 to 90 °C. This finding was obtained from analysis of the temperature‐dependent spectra using the singular value decomposition method. The study presents KAA‐containing oligopeptides as conformationally stable models of biologically important cationic peptides and proteins. Copyright © 2009 European Peptide Society and John Wiley & Sons, Ltd.     

Reproduction mode of European Bitterling (Rhodeus amarus,Bloch, 1782) determined through rapid oocyte counts and size determination using digital imaging

This study focuses on assessing the reproduction mode of an important model species for evolutionary and behavioural ecology by using digital image analysis: the European bitterling Rhodeus amarus (Bloch, 1782). Specifications of mode of reproduction were determined using oocyte size distribution, seasonal dynamics in mean oocyte diameter and total number of oocytes in ovary samples gained from April to July 2007. The rapid oocyte count was enabled by using lucia image analysis software, which also provided measurement and colour estimations of oocytes. Bitterling ovaries showed features typical for indeterminate spawners, i.e. a continuous distribution of oocyte size over the reproductive season and recruitment of new pre‐vitelogenic oocytes in the second half of the reproductive season. These results are consistent with the view that the European bitterling is a batch spawning fish with indeterminate fecundity.     

Streptomyces rimosus extracellular proteases 3. Isolation and characterization of leucine aminopeptidase

Summary A leucine aminopeptidase was purified to homogeneity fromStreptomyces rimosus culture filtrates, which are waste broth of oxytetracycline bioproduction process. Purification procedure includes ultrafiltration and chromatography on CM-Sephadex, AH-Sepharose and FPLC Mono S column. The enzyme is a monomer with molecular weight of 27,500 Daltons and pI of 7.3, stable in broad pH range and up to 70°C. It is a metallo enzyme dependent on Ca²⁺ ions for its full activity. By its specificity it is a true aminopeptidase active on amino acid amide, arylamide, peptide and ester bonds. The hydrolysing activity shows preference for leucine at the N-terminal position of substrates, also acts on aromatic acids and methionine, but does not release glycine, proline, acidic amino acids orD-amino acid residues.     

Adiaspiromycosis in large free living carnivores

Adiaspiromycosis was identified in 6 animals in the examination of the lungs of 90 large carnivores. Emmonsia crescens (Chrysosporium parvum var. crescens) was demonstrated as the causative agent in 5 cases of disease — in the badger (Meles meles), the otter (Lutra lutra) and the fox (Vulpes vulpes). E. parva was demonstrated in the remaining case of disease in a fox. The badger is a new, up to the present unknown host of E. crescens. The sporadic occurrence of adiaspiromycosis in the fox and the otter classifies this disease among rare diseases of these animals.     

Backbone assignment and secondary structure of the PsbQ protein from Photosystem II

PsbQ is one of the extrinsic proteins situated on the lumenal surface of photosystem II (PSII) in the higher plants and green algae. Its three-dimensional structure was determined by X-ray crystallography with exception of the residues 14–33. To obtain further details about its structure and potentially its dynamics, we approached the problem by NMR. In this paper we report ¹H, ¹⁵N, and ¹³C NMR assignments for the PsbQ protein. The very challenging oligo-proline stretches could be assigned using ¹³C-detected NMR experiments that enabled the assignments of twelve out of the thirteen proline residues of PsbQ. The identification of PsbQ secondary structure elements on the basis of our NMR data was accomplished with the programs TALOS+, web server CS23D and CS-Rosetta. To obtain additional secondary structure information, three-bond H_N-H_α J-coupling constants and deviation of experimental ¹³C_α and ¹³C_β chemical shifts from random coil values were determined. The resulting “consensus” secondary structure of PsbQ compares very well with the resolved regions of the published X-ray crystallographic structure and gives a first estimate of the structure of the “missing link” (i.e. residues 14–33), which will serve as the basis for the further investigation of the structure, dynamics and interactions.     

Adiponectin inhibits spontaneous and catecholamine-induced lipolysis in human adipocytes of non-obese subjects through AMPK-dependent mechanisms

Adiponectin is an adipokine increasing glucose and fatty acid metabolism and improving insulin sensitivity. The aim of this study was to investigate the role of adiponectin in the regulation of adipocyte lipolysis. Human adipocytes isolated from biopsies obtained during surgical operations from 16 non-obese and 17 obese subjects were incubated with 1) human adiponectin (20 microg/ml) or 2) 0.5 mM AICAR - activator of AMPK (adenosine monophosphate activated protein kinase). Following these incubations, isoprenaline was added (10(-6) M) to investigate the influence of adiponectin and AICAR on catecholamine-induced lipolysis. Glycerol concentration was measured as lipolysis marker. We observed that adiponectin suppressed spontaneous lipolysis by 21 % and isoprenaline-induced lipolysis by 14 % in non-obese subjects. These effects were not detectable in obese individuals, but statistically significant differences in the effect of adiponectin between obese and non-obese were not revealed by two way ANOVA test. The inhibitory effect of AICAR and adiponectin on lipolysis was reversed by Compound C. Our results suggest, that adiponectin in physiological concentrations inhibits spontaneous as well as catecholamine-induced lipolysis. This effect might be lower in obese individuals and this regulation seems to involve AMPK.     

Carboxylate and aromatic active-site residues are determinants of high-affinity binding of ω-aminoaldehydes to plant aminoaldehyde dehydrogenases

The crystal structures of both isoforms of the aminoaldehyde dehydrogenase from pea (PsAMADH) have been solved recently [Tylichováet?al. (2010) J Mol Biol396, 870-882]. The characterization of the PsAMADH2 proteins, altered here by site-directed mutagenesis, suggests that the D110 and D113 residues at the entrance to the substrate channel are required for high-affinity binding of ω-aminoaldehydes to PsAMADH2 and for enzyme activity, whereas N162, near catalytic C294, contributes mainly to the enzyme's catalytic rate. Inside the substrate cavity, W170 and Y163, and, to a certain extent, L166 and M167 probably preserve the optimal overall geometry of the substrate channel that allows for the appropriate orientation of the substrate. Unconserved W288 appears to affect the affinity of the enzyme for the substrate amino group through control of the substrate channel diameter without affecting the reaction rate. Therefore, W288 may be a key determinant of the differences in substrate specificity found among plant AMADH isoforms when they interact with naturally occurring substrates such as 3-aminopropionaldehyde and 4-aminobutyraldehyde.     

Über die Beziehungen zwischen Muskelfasern und Bindegewebsfibrillen

Zusammenfassung Es handelt sich um die Frage, wie sich die Muskelfasern mit Bindegewebe — einerseits mit dem interstitiellen Bindegewebe (Endomysium) des Muskels, andererseits mit jenem, an welches sich der Muskel befestigt — verbinden. Unter anderem um die Frage, ob sich die Kraft der sich kontrahierenden Muskelfasern an das Bindegewebe der zweiten Art direkt oder durch Vermittlung des Interstitiums überträgt.Das einfachste Objekt, an dem man diese Frage zu lösen versuchen kann, stellen die lateralen Rumpfmuskeln von Branchiostoma, von Cyklostomen und von Ichthyopsiden. Beim Lösen der Frage berührt man das wichtige Thema vom Ursprung des Bindegewebes — seiner Desmofibrillen — überhaupt.Bei Branchiostoma fehlt in den Myomeren der lateralen Rumpfmuskeln das Bindegewebe, und die einheitlichen, d. i. syncytial gebauten Myomeren sind hier als Ganzes von Sarkolemm begrenzt; ihre kontraktile Substanz hat in den Desmofibrillen der Myosepten Fortsetzung (Studnika, 1920).Bei Petromyzon bestehen die Rumpfmuskeln aus großen, ziegelförmigen Muskelkästchen, die zuerst durch einheitliche (innere) Sarkolemme, nach ihrer Spaltung durch ein spärliches interstitielles Bindegewebe voneinander getrennt sind. Später zerfallen die Muskelkästchen in breite Zonen und dann in Muskelfasern verschiedener Dicke; zuletzt dringt zwischen die oberflächlichsten davon, die parietalen Muskelfasern, das Bindegewebe in dünnen Schichten hinein (Maurer 1891). Das ist jetzt das Endomysium des Muskels, während dasjenige Bindegewebe, welches die Muskelkästchen bisher voneinander trennte, zum Perimysium internum wird. Die zentralen Muskelfasern der Kästchen sind von Bindegewebe nicht umgeben; sie verbinden sich bloß an ihren Enden (wo sie miteinander verschmelzen) mit den Myosepten. Da im Inneren der Kästchen das Bindegewebe überhaupt fehlt und da das innere Perimysium aus reichlich gewundenen, zum großen Teil quer zu der Richtung der Muskelkästchen verlaufenden Fasergebilden besteht, ist es klar, daß es nicht die in den bekannten Theorien der Muskelkraftübertragung (vgl. S. 36, 37) ihnen zugeschriebene Rolle übernehmen kann.Bei Myxine und bei allen Gnathostomen bestehen die Rumpfmuskeln aus typischen, drehrunden Muskelfasern. Einzelne davon sind voneinander durch ein bindegewebiges Endomysium, ihre Gruppen durch ein Perimysium internum getrennt. Das Endomysium besteht einerseits aus festen exoplasmatischen fibrillenführenden, im fertigen Zustande de norma mit sehr spärlichen Zellen besetzten Lamellen, andererseits aus einem ebenfalls Desmofibrillen und sehr spärliche Zellkerne bzw. Zellen führenden interstitiellen Gerüst. Wieder überzeugt man sich davon, daß die stark, stellenweise sogar wie mäanderförmig gewundenen und dazu größtenteils quer zu der Richtung der Muskelfasern angeordneten Desmofibrillen der Lamellen und des Gerüstes, die von einigen ihnen zugeschriebene Aufgabe nicht besorgen können. — Dieses Verhalten fand ich bei allen von mir untersuchten Ichthyopsiden (in einzelnen Fällen, so z. B. bei Esox, waren die interstitiellen Lamellen einfach). Die an ihnen sich befindenden Geflechte waren irgendwo (Esox) sehr dicht und wohl auch fest, anderswo (so bei den Amphibienlarven) äußerst locker gebaut und weich. Bei Selachierembryonen (Torpedo, Spinax) konnte ich mich davon überzeugen, daß alle diese interstitiellen Strukturen auf der Grundlage des Mesostroma-Mesenchyms, also eines Zellbrückennetzes, entstehen. An der Bildung des Mesostromas beteiligen sich offenbar auch die jungen Muskelfasern, doch am fertigen Gewebe läßt sich ein Zusammenhang des Gerüstes mit dem Sarkolemm nicht nachweisen.Sowohl die Muskelfasern (an ihren Enden) wie auch die interstitiellen Lamellen sind mit den Myosepten fest verbunden; die Lamellen bilden zusammen mit ihnen ein interstitielles Muskelgerüst, in dessen Lücken die Muskelfasern sonst ziemlich frei liegen. Man sieht dieses Gerüst in jenen Fällen sehr deutlich, in denen sich die Muskelfasern bei der Fixierung der Objekte stark kontrahierten und sich von dem Myoseptum abgerissen haben, so daß das Muskelgerüst stellenweise leer geworden ist. Das quergestreifte Muskelgewebe ist auf diese Weise ein Beispiel eines nicht aus Zellen gebauten Gewebes mit (im fertigen Zustande) relativ sehr spärlichen Zellen.Die Muskelfasern verbinden sich mit den Myosepten auf verschiedene Weise. In den jungen Entwicklungsstadien der Kranioten gibt es in der Gegend, wo sich später die Myosepten befinden, zuerst bloß Lücken, die von Cytodesmen, von Mesostroma und zuletzt von bindegewebigen Längsfasern überbrückt werden. Die Längsfasern sind Desmofibrillenbündel, welche sich von den Enden der Muskelfasern der einen zu denen der folgenden Myomere ziehen und beide fest miteinander verbinden. In älteren Entwicklungsstadien gibt es in den Lücken auch Bindegewebsfasern, die in anderer Richtung verlaufen, und zuletzt überwiegen hier die Querfasern; solche Bindegewebsfasern nämlich, welche in der Richtung der Lücke verlaufen. Auf diese Weise entsteht an der Stelle der intermyomeralen Lücke im fertigen Körper schließlich ein festes bindegewebiges Myoseptum. Es gibt Myosepten mit verschiedener Anordnung der Desmofibrillen und ihrer Bündel.Da man sich auf das interstitielle Bindegewebe nicht berufen kann, ist es klar, daß sich die Zugwirkung der sich kontrahierenden Muskelfasern durch ihre Enden, welche sich an die Myosepten festsetzen, an diese letzteren überträgt.Wo es in den intermyomeralen Lücken, dann in den Myosepten, die obenerwähnten Längsfasern gibt — und solche fand ich anfangs bei allen von mir untersuchten Formen — stellen diese Fasern gewissermaßen die Fortsetzung der Myofibrillen vor. Entweder sind die Enden der Muskelfasern nackt, und die Myofibrillen gehen unmittelbar in die Desmofibrillen und ihre Bündel über, oder sind die Enden der Muskelfasern durch das Sarkolemm begrenzt, und die Fasergebilde treten dann durch das Sarkolemm hindurch; in noch anderen Fällen muß man annehmen, daß sich auf die eine Seite des Sarkolemms die Myo-, auf die andere (äußere) Seite die Desmofibrillen festsetzen. Das exoplasmatische Sarkolemm stellt dabei keine tote Scheidewand zwischen den beiden Arten der Fibrillen vor. Die Desmofibrillen sind oft zu Bündeln verbunden, und ihre Anzahl ist dann geringer als jene der Myofibrillen.Bei Amphibienlarven entfernen sich gegen das Ende der Schwanzflosse zu die Myomeren voneinander, und aus jenem Materiale, welches in den vorderen Teilen des Körpers die Myosepten baut, entstehen da förmliche Sehnen; in Anbetracht des Umstandes, daß es sich (beim Ende der Flosse) um Fibrillenbündel handelt, welche die einzelnen Muskelfasern miteinander verbinden, sind es eigentlich Mikrosehnen. In diesen Fällen sieht man den Übergang der Desmofibrillen in Myofibrillen besonders deutlich, und man kann ihn — bei Pelobates-Larven — sogar auch an im frischen Zustande untersuchten (zerdrückten) Objekten untersuchen.Dort, wo man den direkten Zusammenhang der Fasergebilde nicht beobachten kann, sieht man an der Stelle des Septums, wo die sich kontrahierenden Muskelfasern von ihm weggerissen haben, manchmal Reste der zerrissenen Desmofibrillen, zum Zeichen, daß hier die Myofibrillen wirklich mit den Desmofibrillen im Zusammenhange standen. In sehr zahlreichen Fällen beobachtet man bei älteren Tieren jedenfalls auch dies nicht; man bekommt dann den Eindruck, als ob die Enden der Muskelfasern mit dem Myoseptum bloß verklebt wären. Es gelang bisher nicht, die zwischen den anders verlaufenden Fibrillen sich befindenden und zur Befestigung der Muskelfasern dienenden Desmofibrillen in allen Fällen zu finden.     

The potentiation of myeloperoxidase activity by the glycosaminoglycan-dependent binding of myeloperoxidase to proteins of the extracellular matrix

Background

Myeloperoxidase (MPO) is an abundant hemoprotein expressed by neutrophil granulocytes that is recognized to play an important role in the development of vascular diseases. Upon degranulation from circulating neutrophil granulocytes, MPO binds to the surface of endothelial cells in an electrostatic-dependent manner and undergoes transcytotic migration to the underlying extracellular matrix (ECM). However, the mechanisms governing the binding of MPO to subendothelial ECM proteins, and whether this binding modulates its enzymatic functions are not well understood.

Methods

We investigated MPO binding to ECM derived from aortic endothelial cells, aortic smooth muscle cells, and fibroblasts, and to purified ECM proteins, and the modulation of these associations by glycosaminoglycans. The oxidizing and chlorinating potential of MPO upon binding to ECM proteins was tested.

Results

MPO binds to the ECM proteins collagen IV and fibronectin, and this association is enhanced by the pre-incubation of these proteins with glycosaminoglycans. Correspondingly, an excess of glycosaminoglycans in solution during incubation inhibits the binding of MPO to collagen IV and fibronectin. These observations were confirmed with cell-derived ECM. The oxidizing and chlorinating potential of MPO was preserved upon binding to collagen IV and fibronectin; even the potentiation of MPO activity in the presence of collagen IV and fibronectin was observed.

Conclusions

Collectively, the data reveal that MPO binds to ECM proteins on the basis of electrostatic interactions, and MPO chlorinating and oxidizing activity is potentiated upon association with these proteins.

General significance

Our findings provide new insights into the molecular mechanisms underlying the interaction of MPO with ECM proteins.