草鱼呼肠孤病毒NS31蛋白在昆虫细胞中表达及互作多肽筛选

草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus,GCRV)是引发病毒性草鱼出血病的主要病原.前期研究证实GCRV-S7基因片段编码NS31蛋白是GCRV的非结构蛋白,在病毒感染的中后期表达.为深入开展NS31的具体生物学功能,本研究从GCRV-JX01株病毒基因组中扩增NS31,克隆至pFastBacHTA载体;利用杆状病毒Bac-to-Bac系统成功表达携带his标签的重组蛋白his-NS31;Western-Blot和IFA实验表明重组杆状病毒能够感染昆虫细胞(Sf9)表达NS31,进一步通过his-Ni2+柱纯化NS31,SDS-PAGE鉴定蛋白约为30KD.运用噬菌体展示技术筛选噬菌体12肽库,研究NS31特异性结合多肽.挑取30个克隆进行DNA序列测定,结果表明NS31主要和2种多肽分子相互作用.进一步结合生物信息学分析表明上述多肽与草鱼基因组中6个基因具有同源性,提示其可能是NS31互作蛋白.本研究为深入探索NS31在病毒感染过程中的生物学功能奠定了重要基础.     

含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-1)对猪伪狂犬病毒复制的影响

猪伪狂犬病是伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种烈性接触性传染病,其感染宿主会触发机体先天免疫应答,引起I型干扰素(Type I interferon,IFN-1)和炎性细胞因子等细胞因子的产生,为研究可诱导产生炎性细胞因子的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase 1,caspase-1)的基因敲除对PRV复制的影响,本试验利用近年来发展迅速的一项规律性短重复回文序列簇/Cas9核酸酶(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated system 9,CRISPR/Cas9)基因定点修饰技术构建猪肾上皮细胞(Porcine kidney epithelial cells,PK15)caspase-1基因稳定敲除细胞系,并通过T7核酸酶检测敲除效率;细胞毒性(Cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒检测PK15敲除caspase-1增殖影响;采用流式细胞术检测PRV-GFP感染PK15以及PK15-caspase-1^-/-的增殖差异;实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR)检测PRV-gB、TK及白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IFN-β、干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes 20,ISG20)mRNA的表达;Western Blot检测PRV-gB蛋白表达;滴度测定检测子代病毒滴度。结果表明,2对特异性单链引导RNA(Single guide RNA,sgRNA)均能对caspase-1进行基因编辑,但经T7核酸酶酶切进行基因编辑效率分析结果表明sgRNA2的基因编辑效率较高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明caspase-1基因敲除对PK15以及PK15-caspase-1^-/-细胞活力无影响(P>0.05);流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-caspase-1^-/-中的增殖显著低于PK15细胞(P<0.05);定量RT-PCR结果表明PRV-gB、TK基因在PK15-caspase-1^-/-的mRNA表达显著低于PK15细胞(gB:P<0.05,TK:P<0.05),而IFN-β、ISG20基因在PK15-caspase-1^-/-的mRNA表达显著高于PK15细胞(gB:P<0.05,TK:P<0.05);Western Blot结果表明,PRV的gB蛋白在PK15-caspase-1^-/-的表达显著低于PK15细胞(P<0.05);滴度测定结果表明,敲除caspase-1能够抑制PRV子代病毒的增殖。以上结果均表明caspase-1基因敲除可抑制PRV在PK15细胞中复制。     

长白山阔叶红松林不同演替阶段林下红松幼苗能量与养分季节动态

为了解林下红松幼苗生长和养分存储季节动态,以长白山原始阔叶红松林(原始林)和次生杨桦林(次生林)林下2年生红松幼苗为对象,研究林下光合有效辐射(PAR)、幼苗生物量、非结构性碳水化合物(NSC)、全氮(N)和全磷(P)等指标的季节变化,分析两林分林下光照的季节动态及其差异对红松幼苗生长和养分积累的影响。结果表明: 原始林和次生林林下月PAR累积量季节变化都呈“双峰”型,夏季为郁闭期,两林分林下光线弱。春季和秋季为阔叶树无叶期,林下光照条件变好,且次生林林下光照明显好于原始林;原始林和次生林红松幼苗的生物量、NSC、全N和全P浓度的季节动态与林下光照的季节变化基本一致,在春季和秋季表现为显著增加,在夏季呈下降趋势。春季幼苗的淀粉浓度增加,夏季淀粉和可溶性糖浓度均逐渐降低,到8月达到最低值,秋季可溶性糖浓度显著升高。春季和秋季次生林林下幼苗的生物量和NSC浓度整体上均显著高于原始林,而夏季两林分差异不显著。因此,春季和秋季的林下光照条件差异是影响原始林和次生林中红松幼苗养分积累和生长更新差异的主要原因。     

利用APSIM模型分析不同播期和耕作方式对旱地小麦籽粒干物质积累的影响

黄土丘陵区旱地小麦籽粒干物质积累的准确模拟可为调控小麦生产提供重要的技术支持。本研究利用甘肃省定西市安定区1971—2017年的气象资料和甘肃省定西市安定区凤翔镇安家沟村2016—2017年的大田试验数据,基于APSIM模型对旱地小麦籽粒干物质积累与分配进行模拟,并在模型验证的基础上,定量分析了播期和耕作方式对小麦籽粒干物质积累的影响。结果表明: 3个播期(早播、正常播、晚播)和4种耕作方式(传统耕作、传统耕作+覆盖、免耕、免耕+覆盖)下,籽粒干物质模拟值与实测值间的均方根误差(RMSE)为57.5～143.1 kg·hm^-2,归一化均方根误差(NRMSE)为1.4%～9.9%,模型模拟精度较高。不同播期下,耕作方式对籽粒干物质积累的促进效果排序均表现为: 免耕+覆盖>传统耕作+覆盖>免耕>传统耕作,免耕+覆盖最有利于小麦籽粒干物质积累,而免耕与传统耕作差异不显著。不同耕作方式下,小麦干物质积累过程均表现为早播好于正常播和晚播,晚播对干物质积累的影响较大,积累过程最不理想。     

体外转录的自我复制型mRNA疫苗研究进展*

自我复制型mRNA是一种灵活的疫苗平台,该平台的开发基于甲病毒表达载体,其中复制必需基因得以完整保留,而结构蛋白基因则被来自病原的抗原基因替换。由于避免了病原培养、毒力返强和现存免疫的干扰,使其成为疫苗快速设计的理想平台。大量研究数据显示,此类疫苗可应用在人、小鼠、兔、猪、禽甚至鱼类体内诱导体液免疫和细胞免疫。过去,自我复制mRNA疫苗的研究采用重组单载体的模式,基因组骨架来源于辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒和委内瑞拉马脑炎病毒。现在,反式复制型RNA和核酸修饰的反式复制型RNA作为下一代技术平台被寄予厚望。对基于甲病毒表达载体的mRNA疫苗技术的研究进展进行概述,重点介绍针对以流感病毒、新型冠状病毒和寨卡病毒等为代表的自我复制型mRNA疫苗研究现状,并探讨了该技术平台的未来发展方向。     

聚多巴胺的表面修饰功能在组织工程的应用进展*

聚多巴胺作为贻贝的仿生材料,可由多巴胺在碱性环境中自发形成。由于其较好的黏附特性以及组织相容性,在生命科学等领域有着广泛的应用。将聚多巴胺对材料进行表面修饰,既可以保护材料免受强氧化剂、酸碱等外界的侵蚀,也可以通过表面改性赋予材料新的功能,使其在各领域发挥更好的作用。对聚多巴胺的制备原理、生物性能,以及近年来在组织工程领域(骨组织、软骨组织、硬脑膜组织、血管组织、耳组织)的运用进行综述,以期为后续聚多巴胺作为组织工程黏附材料的研究提供参考。     

引入新型异戊二烯醇利用途径促进解脂耶氏酵母中β-胡萝卜素的合成*

目的:微生物体内异戊二烯类化合物的前体物异戊烯焦磷酸酯的天然合成路径受到严格的代谢调控,因此限制了异戊二烯类化合物的高效生物合成,而新型异戊二烯醇利用途径独立于生物体内源性代谢路径,通过在微生物中引入IUP能够进行异戊烯焦磷酸酯的大量合成,从而促进异戊二烯类化合物的大量合成。方法:在油脂酵母解脂耶氏酵母中引入IUP,强化异戊烯焦磷酸酯生物合成,促进β-胡萝卜素的高效积累。结果:通过生物信息学的方法预测IUP中两个关键蛋白酿酒酵母来源的胆碱激酶ScCK和拟南芥来源的异戊烯磷酸激酶AtIPK,均为酸性亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽,二者都具有疏松不稳定的结构特征,显著富集于磷酸类物质的合成通路中。在解脂耶氏酵母中利用同源重组技术引入外源β-胡萝卜素合成关键基因carRP和carB,强化甲羟戊酸途径的关键基因thmgR和ggs1,使工程菌株中积累2.68 mg/L β-胡萝卜素。通过Cre-loxP系统回收基因组上的ura标签,再将IUP进一步整合到工程菌株染色体上。当培养基中含有20 mM异戊二烯醇作为底物、碳氮比为4/3且发酵96 h后,重组解脂耶氏酵母中β-胡萝卜素的产量提高到410.2 mg/L,较原始工程菌的产量提高了近200倍。结论:IUP能够促进解脂耶氏酵母中β-胡萝卜素的高效积累,为利用IUP开展β-胡萝卜素和其他异戊二烯类化合物的高效生物合成提供新思路。     

丙泊酚对全肝缺血再灌注大鼠脑损伤的保护作用及机制研究

目的:探究丙泊酚对全肝缺血再灌注(THIR)大鼠脑损伤的保护作用及机制。方法:选取72只健康成年雄性SD大鼠,将其按照抽签法分成假手术组、对照组以及丙泊酚组。所有大鼠予以12h禁食处理,采用3%戊巴比妥钠行腹腔注射麻醉处理,常规消毒后取上腹部正中切口进入腹腔。假手术组仅暴露肝门,不予以阻断处理。对照组与丙泊酚组则以无创动脉夹阻断肝固有动脉、门静脉和胆总管,在右肾动脉水平处阻断肝下下腔静脉,膈肌水平阻断肝上下腔静脉,进入全肝缺血阶段,阻断30 min后去除动脉夹恢复肝血流。其中丙泊酚组在全肝缺血前10 min予以丙泊酚50 mg/kg腹腔注射干预,假手术组与对照组则予以等量的生理盐水腹腔注射干预。比较三组大鼠再灌注24h后的脑组织细胞凋亡率、特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达水平,脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)水平,血清白介素-6(IL-6)以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。结果:对照组与丙泊酚组大鼠的细胞凋亡率及Caspase-3相对表达量均高于假手术组,而丙泊酚组细胞凋亡率及Caspase-3相对表达量均低于对照组(均P<0.05)。对照组与丙泊酚组大鼠脑组织SOD水平均低于假手术组,而丙泊酚组脑组织SOD水平高于对照组;对照组与丙泊酚组大鼠脑组织MDA、NO水平均高于假手术组,而丙泊酚组脑组织MDA、NO水平低于对照组(均P<0.05)。对照组与丙泊酚组大鼠血清IL-6、TNF-α水平均高于假手术组,而丙泊酚组血清IL-6、TNF-α水平均低于对照组(均P<0.05)。结论:丙泊酚可有效抑制THIR大鼠脑损伤引起的细胞凋亡,其主要机制可能与抑制Caspase-3表达、炎症反应以及抗自由基损伤有关。     

青藏高原不同高寒草地类型土壤酶活性及其影响因子

土壤酶活性作为生态系统养分循环的关键因素, 是反映土壤质量和生态系统功能的重要指标, 但是关于高寒草地生态系统中不同草地类型间酶活性的差异研究还很少。因此, 该研究在藏北高寒草地选择高寒草甸、高寒草原、高寒草甸草原、高寒荒漠草原和高寒荒漠5种草地类型进行野外原位调查和采样, 测定了涉及碳(C)、氮(N)和磷(P)循环的14种酶的活性, 并建立了高寒草地酶活性与土壤微生物和土壤理化性质等环境因子的关系。结果表明: C循环酶(蔗糖酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、多酚氧化酶和过氧化物酶)和P循环酶(碱性磷酸酶)在不同高寒草地类型间活性差异明显, N循环酶中仅芳香氨基酶和亚硝酸盐还原酶两种酶在不同高寒草地类型间活性差异明显。同时, C、N和P循环酶之间存在一定的相关关系, 其中, 蔗糖酶和碱性磷酸酶、纤维素酶和α-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性显著正相关, 多酚氧化酶与亚硝酸还原酶和β-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性显著负相关。在测定的19个环境指标中, 土壤有机质(SOM)含量、革兰氏阴性菌数量、土壤N和P含量计量比、革兰氏阳性菌数量、细菌数量、放线菌数量、全氮含量、真菌数量是影响土壤酶活性的关键因子, 且SOM含量的影响最大(解释量为11.9%)。综上所述, 不同高寒草地类型间C循环酶、P循环酶和两种N循环酶(芳香氨基酶和亚硝酸还原酶)活性差异显著, SOM含量、微生物数量和N含量等是影响高寒草地生态系统土壤酶活性的关键因子。