产乙醇大肠杆菌的构建及其活性检测方法的改进

adhB和pdc是运动发酵单胞菌产乙醇途径的关键基因,分别编码乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶,将添加有聚球藻PCC7942rbcLS基因RBS序列的adhB和pdc基因插入pUC18载体,经双重菌液PCR检验和酶切检验得到分别含有pUC-adhB、pUC-pdc和pUC-adhB-pdc载体的3个重组菌株。活性检测实验表明聚球藻PCC7942的rbcLS基因的RBS序列能有效介导运动发酵单胞菌的adhB和pdc基因在大肠杆菌中表达,摇瓶发酵实验表明重组大肠杆菌的产乙醇能力较出发菌株大幅提升。鉴于乙醛指示平板法存在着对希夫试剂的要求较高、易产生较强的背景色等缺点,对定性检测丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶表达菌株的方法做了改进,即:将菌液诱导表达,然后分别添加对应于两种酶的底物,让酶与底物反应0.5至1小时,之后再加希夫试剂进行显色反应,结果表明改进后的方法比乙醛指示平板法更加简便、快速、可靠。     

人干扰素α-2b基因在烟草中的表达研究

应用PCR的技术从质粒pAIFN中扩增人干扰素α-2b(Human interferon α-2b,HuIFN α-2b)编码基因,将其连接到pBI121双元载体构建植物真核表达载体pBIFN;用冻融法将该载体转染根癌农杆菌LBA4404;并用叶盘浸染法转化烟草叶片,经转化的烟草叶片的组织培养,诱导愈伤获得再生植株。通过应用PCR,RT-PCR,Wes-tern blot和WISH/VSV方法检测获得的烟草再生植株,结果表明HuIFN α-2b基因已成功整合进烟草核基因组并表达出具有活性的HuIFN α-2b蛋白。本文对HuIFN α-2b基因在烟草核系统中的表达进行了研究,为进一步在烟草叶绿体系统中该基因的表达研究奠定了基础。     

自体骨髓单个核细胞移植治疗缺血性下肢血管病变患者254例

目的探讨自体骨髓单个核细胞移植在下肢缺血性疾病治疗中的应用并评价其疗效。方法回顾性总结分析解放军第四六三医院细胞治疗中心2003年11月至2008年8月住院的具有完整随访资料的下肢缺血性疾病患者254例,经动员后采集及分离自体骨髓,行下肢自体骨髓单个核细胞移植术。随访时间为1年。术后随访指标：3、6、12个月后复查皮温、深感觉、经皮氧分压和踝肱比,随访疼痛、冷感和跛行距离,观察溃疡和坏疽情况。采用F检验分析差异的统计学意义。结果完成随访254例患者。（1）患者的疼痛缓解率为61．8％（157例／254例）,冷感缓解率缓解率74．0％（188例／254例）,跛行好转率40．2％（102例／254例）,溃疡好转率59．0％（36例／61例）,坏疽截肢6例,脱落愈合5例,无变化8例,扩大7例;（2）患者下肢皮温由32．89℃±2．19℃上升至35．52℃±2．26℃（t=13．32,P=0．000）,深感觉缓解由（26．20±15．78）mV下降至（20．34±10．86）mV（t=4．901,P=0．000）,经皮氧分压由（26．46±18．49）mmHg上升至（34．14±14．99）mmHg（t=5．157,P=0．000）,踝肱比由0．62±0．36上升至0．84±0．24（t=8．104,P=0．000）。结论骨髓单个核细胞移植治疗下肢缺血性血管病有效,是一种简单的、有效的治疗下肢动脉缺血性疾病的方法。     

尖端赛多孢子菌引起的真菌性鼻窦炎1例并文献复习

目的 探讨尖端赛多孢子菌的实验室检测方法,了解其对5种常用抗真菌药物的体外敏感性.通过对相关文献的复习,熟悉真菌性鼻窦炎的临床表现和诊治方法.方法 将1例尖端赛多孢子菌引起的真菌性鼻窦炎患者经鼻内腔镜手术切除的团块用10％ KOH压片镜检、涂片革兰染色镜检、沙堡弱培养基培养、分子生物学方法鉴定到种.分离株应用E-test进行体外药敏试验.结果 鉴定为尖端赛多孢子菌.5种药物对其MIC范围分别为:伏立康唑0.064 μg/mL,卡泊芬净1.500 μg/mL,氟康唑16.000 μg/mL,两性霉素B＞32.000 μg/mL,5-氟胞嘧啶＞32.000 μg/mL.结论 尖端赛多孢子菌引起的真菌性鼻窦炎国内少见报道,易与肿瘤相混淆;实验室检测对正确诊断起决定性作用;行鼻内腔镜下手术治疗效果较好.了解该菌的耐药性对指导抗真菌治疗尤为关键.     

药用植物款冬花芽分化过程观察

实验以不同生长发育阶段的款冬花序芽突起为材料,通过制作石蜡切片,在显微镜下观察款冬花序芽分化各阶段的形态特征。结果表明:款冬花序芽从7月上旬开始花序(盘)分化至十月初小花胚珠分化完成,分化时期可分为分化前期、花盘形成期、花原基分化期、中央花(筒状)花瓣原基分化期、中央花雄蕊原基分化期、中央花雌蕊原基分化期、边缘花(舌状)花瓣原基分化期、边缘花雌蕊原基分化期、中央花花粉分化形成期、子房胚珠分化期共10个时期,阐明了款冬花序芽分化各时期与生长时间的关系。     

尘螨变应原Der f1 真核表达载体的构建及转染CHO 细胞

目的:构建尘螨变应原Der f1真核表达载体,转染真核细胞并进行蛋白表达.方法:根据Genebank中Der f1基因的核酸序列(AB034946),设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Der f1编码基因,克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-hisA上,以脂质体法转染CHO细胞,经G418筛选,进行稳定表达细胞株的筛选和鉴定.结果:将目的基因Der f1成功连接到pcDNA3.1/myc-hisA-Derf1并转染CHO细胞,获得稳定表达的CHO细胞株.结论:成功构建了尘螨变应原Der f1真核表达载体,并转染CHO细胞表达蛋白质.     

结缔组织生长因子在慢性阻塞性肺疾病血管重建中表达研究

目的:探讨结缔组织生长因子(CTGF)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)血管重建中的表达及意义。方法:将30例有吸烟史的男性鳞癌需要手术的患者按其肺功能结果分成二组,对照组:(肺功能正常组);COPD稳定期组:(肺功能异常组),每组15例,标本来自于癌旁的肺组织,肺血管重塑的形态学观察行HE和MASSON三色染色,行免疫组化来观察CTGF蛋白、PCNA蛋白在肺血管平滑肌中的表达。结果:(1)COPD组肺动脉管壁面积/管总面积(WA%)、管壁的胶原厚度、肺动脉平滑肌中CTGF蛋白及PCNA蛋白的表达与对照组相比差异有统计学意义。(2)CTGF与管壁面积/管总面积(WA%)、管壁的胶原厚度及血管平滑肌中PCNA表达呈正相关(,r值分别为0.81、0.68、0.86,P<0.05)。吸烟指数与管壁面积/管总面积及PCNA的表达呈正相关(r=0.73,0.99,P<0.01)。结论:单纯吸烟者即有血管重建,吸烟伴COPD者血管重建更加严重,CTGF在COPD患者肺血管中的表达较对照组高,可能参与了COPD血管重建过程。     

rhBMP-2 诱导异位软骨修复重建兔气管缺损的实验研究

目的:探讨重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)作为激活物诱导异位软骨修复并重建兔气管缺损的可行性。方法:取24只新西兰大白兔,制备气管前壁软骨1/3缺损模型。随机分为A、B组,每组12只,A组为实验组,在气管缺损处前壁颈前肌肉修补,多点注射rhBMP-2;B组于气管软骨缺损部位直接颈前肌群修补。术后观察动物一般情况,于4、8、12周取材进行大体观察、HE染色观察重建区域情况。结果:术后A组动物均存活至实验完成,B组因气道感染及气道分泌物堵管潴留致使实验兔死亡,其余动物出现皮下气肿,呼吸不畅等情况。组织学观察A组有明显的新生软骨细胞及少量软骨样组织,可见结缔组织包绕,周围肌肉组织完整,排列整齐,未见明显坏死组织,有少量淋巴细胞浸润。B组未见软骨组织生成,可见大量肉芽组织增生,结缔组织排列紊乱,伴少量坏死组织,大量淋巴浸润。结论:rhBMP-2可通过注射到颈前肌肉修补肌群中诱导软骨细胞和软骨样组织生成,减轻炎症反应,联合颈前肌瓣修复重建气管缺损能充分维持修复重建后的气道形态,具有减少术后皮下气肿、气管狭窄的作用,有望用于临床修复重建气管组织缺损。     

AMI 患者血浆NT-proBNP 水平与心肌缺血及预后关系的研究

目的:探讨急性心肌梗死(AMI)患者血浆N末端B型尿钠肽前体(NT-proBNP)的水平与心肌缺血及预后的关系。方法:98例急性心肌梗死患者根据患者是否行直接PCI手术治疗,分为PCI手术治疗组和非PCI治疗组,观察缺血改善情况与NT-proBNP水平的关系,同时根据治疗后NT-proBNP的水平分为三组,A组NT-proBNP<125pg/ml、B组125pg/ml≤NT-proBNP<450pg/ml、C组NT-proBNP≥450pg/ml,观察NT-proBNP的水平与预后的关系。结果:行PCI组NT-proBNP的水平下降程度(438.3±134.5)明显高于未行PCI组者(158.6±146.1,P<0.05),MACE的发生情况C组明显高于A组(P=0.006<0.01),也高于B组(P=0.028<0.05),A组与B组相比,B组的MACE发生率有上升的趋势,但是无统计学意义(P=0.432>0.05)。结论:急性心肌梗死患者早期血浆NT-proBNP的水平在一定程度上可以反应心肌的缺血程度,且与患者的预后成明显的负相关。     

AKT2 基因短发夹结构RNA 慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建丝/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法:利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果:成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论:成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。