核酸去甲基酶AlkB在毕赤酵母中的表达纯化及在tRNA相关研究中的应用

[目的]核酸的甲基化修饰是一种常见的化学修饰形式,具有重要的生物学功能,却也在一定程度上给一些核酸研究过程带来了技术难度。tRNA上具有的大量甲基化修饰会阻碍逆转录进程,从而降低荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和高通量测序对其的检测效率。来自大肠杆菌(Escherichia coli)的AlkB蛋白是一种多功能的脱烷基化酶,可以去除DNA和RNA上多种甲基化为代表的修饰,有望解决以上问题。[方法]针对大肠杆菌来源的AlkB,分别尝试在大肠杆菌和毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中进行诱导表达和纯化,对纯化获得的AlkB进行酶学性质测定。最后以tRNA_UAU^Ile等两种tRNA为代表,研究AlkB的处理对于荧光定量PCR法检测tRNA表达水平的影响。[结果]AlkB在大肠杆菌中表达时多以包涵体形式存在,但是在毕赤酵母中可以成功分泌表达。使用镍柱分离纯化后获得了纯度高于95%的AlkB蛋白,其酶学性质参数如...     

高产杀粉蝶菌素的链霉菌鉴定及其拮抗水稻白叶枯菌活性研究

【目的】为保证农业生产可持续性发展,研发和使用环境友好的生物农药受到全社会的高度重视。微生物代谢产物农药是我国目前应用最广的生物农药,也是未来发展绿色农药的一个重要方向。【方法】利用包含水稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo) PXO99A的NA培养基琼脂平板,从水稻根际土壤中筛选能抑制Xoo生长的链霉菌。通过高效液相色谱和质谱分析活性代谢产物的化学结构;采用剪叶法接种Xoo到水稻叶片后,再喷施杀粉蝶菌素溶液(0.1 g/L),2周后测定叶枯症状;采用响应面分析法优化高产杀粉蝶菌素的发酵培养基;采用PacBio SMRT测序平台+Illumina HiSeq X Ten平台开展全基因组测序。平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)用于比较HSW2009与其他链霉菌在全基因组水平的亲缘关系。【结果】分离到一株对Xoo生长有强抑制活性的链霉菌HSW2009,其活性代谢产物为杀粉蝶菌素A1(piericidin A1,简称PIE);喷施PIE可以减轻Xoo在水稻叶片内的侵染;优化HSW2009高产PIE的发...     

基于细胞色素c的胞外电子传递过程

电活性微生物具有独特的胞外电子传递功能,在地球化学循环和环境污染修复中起着重要作用。细胞色素c在电活性微生物胞外电子传递过程中扮演了重要角色,不仅参与直接电子传递途径,还参与电子媒介介导的间接电子传递。其电子传递功能不仅对地球环境中铁、锰、碳等元素的循环具有重要作用,还应用于能源生产、废水处理、生物修复等众多领域,具有良好的应用潜力。本文以电活性微生物的2个模式菌属(希瓦氏菌属和地杆菌属)为例,综述了电活性微生物将电子由胞内转移至胞外的方式和途径,详细阐述了细胞色素c在该胞外电子传递过程中的重要作用,总结了细胞色素c介导的胞外电子传递过程所涉及的分析方法,并对微生物胞外电子传递未来的研究方向提出了展望。     

绿色木霉组蛋白去乙酰化酶编码基因TvRpd3在木霉生物防治作用中的功能分析

【目的】本文借助基因编辑技术在具有生物防治潜力的绿色木霉(Trichoderma viride)中敲除组蛋白去乙酰化酶编码基因TvRpd3,来研究TvRpd3基因及其编码蛋白在提高木霉病原菌拮抗能力中的作用。【方法】利用融合PCR和同源重组策略构建了TvRpd3基因缺失的突变菌株,通过对峙培养、表型观察、免疫组化检测、代谢组学分析等系统比较TvRpd3基因敲除前后菌株的组蛋白乙酰化修饰水平、次级代谢产物合成、病原菌拮抗能力以及田间防治效果等。【结果】与野生型菌株相比,缺失TvRpd3基因的木霉工程菌(?TvRpd3)对多种病原菌表现出了更强的对峙抑制效果,其所产的发酵液对小麦白粉病、烟草黑胫病和番茄枯萎病的防治效果分别提高了62.27%、57.45%和70.71%。同时,敲除TvRpd3基因也显著改变了木霉工程菌所产次级代谢产物的种类和产量,抗生性物质的产量大幅提高。【结论】绿色木霉TvRpd3基因及其介导的组蛋白乙酰化修饰在提高绿色木霉生物防治中起着重要作用。     

棒状腐败乳杆菌Lc7的生物学特性及益生作用

【目的】对分离自健康成人粪便样本的棒状腐败乳杆菌(Loigolactobacillus coryniformis)Lc7进行分类学鉴定和益生潜力评估。【方法】基于16SrRNA基因和基因组核心基因构建系统发育树,对Lc7进行分类学鉴定;通过耐酸和胆汁酸盐、粘附、抗氧化和抑菌实验,以及溶血、明胶酶活性和抗菌药物敏感性实验,评估Lc7的益生特性。同时,构建小鼠溃疡性结肠炎模型,评估Lc7的体内抗炎潜力。【结果】Lc7鉴定为L. coryniformis,在酸和胆汁酸盐的连续作用下,Lc7的存活率为70.17%。Lc7对HT-29细胞的粘附指数为56.33 CFU/cell,其自聚集和疏水性分别为80%和40%;Lc7对福氏志贺菌和鼠伤寒沙门菌等7个常见致病菌均有较强的抑制能力;对1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl,DPPH)和羟自由基(hydroxyl radicals,·OH)的清除率分别为91.70%和48.53%;Lc7无溶血现象和明胶酶活性,对选取的大多数抗生素均敏感。在小鼠结肠炎实验中,Lc7干预组小鼠结肠长度明显长于模型组(...     

The potato StMKK5-StSIPK module enhances resistance to Phytophthora pathogens through activating the salicylic acid and ethylene signalling pathways

Mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades play pivotal roles in plant responses to both biotic and abiotic stress. A screen of a Nicotiana benthamiana cDNA virus-induced gene silencing (VIGS) library for altered plant responses to inoculation with Phytophthora infestans previously identified an NbMKK gene, encoding a clade D MAPKK that we renamed as NbMKK5, which is involved in immunity to P. infestans. To study the role of the potato orthologous gene, referred to as StMKK5, in the response to P. infestans, we transiently overexpressed StMKK5 in N. benthamiana and observed that cell death occurred at 2 days postinfiltration. Silencing of the highly conserved eukaryotic protein SGT1 delayed the StMKK5-induced cell death, whereas silencing of the MAPK-encoding gene NbSIPK completely abolished the cell death response. Further investigations showed that StMKK5 interacts with, and directly phosphorylates, StSIPK. Furthermore, both StMKK5 and StSIPK trigger salicylic acid (SA)- and ethylene (Eth)-related gene expression, and co-expression of the salicylate hydroxylase NahG with the negative regulator of Eth signalling CTR1 hampers StSIPK-triggered cell death. This observation indicates that the cell death triggered by StMKK5-StSIPK is dependent on the combination of SA- and Eth-signalling. By introducing point mutations, we showed that the kinase activity of both StMKK5 and StSIPK is required for triggering cell death. Genetic analysis showed that StMKK5 depends on StSIPK to trigger plant resistance. Thus, our results define a potato StMKK5-SIPK module that positively regulates immunity to P. infestans via activation of both the SA and Eth signalling pathways.     

酶法生产L-高苯丙氨酸的研究进展

L-高苯丙氨酸(L-homophenylalanine,L-HPA)作为一种重要的非天然氨基酸,是合成治疗高血压的普利类药物等的关键中间体,具有广阔的市场前景。目前L-高苯丙氨酸的合成主要依赖于化学法,但化学合成L-高苯丙氨酸具有原料昂贵、步骤繁琐和污染严重等缺点,限制了广泛应用。因此,国内外研究者对L-高苯丙氨酸的酶法生产进行了深入的研究。本文就目前酶法合成L-高苯丙氨酸的工艺,包括脱氢酶法、转氨酶法、海因酶法和脱羧酶法的研究进展进行了综述,为酶法合成L-高苯丙氨酸提供一定的借鉴,为最终实现L-高苯丙氨酸的酶法工业化生产奠定基础。     

谷氨酸棒杆菌代谢工程高效生产L-缬氨酸北大核心CSCD

L-缬氨酸作为一种支链氨基酸,广泛应用于医药和饲料等领域。本研究借助多种代谢工程策略相结合的方法,构建了生产L-缬氨酸的微生物细胞工厂,实现了L-缬氨酸的高效生产。首先,通过增强糖酵解途径、减弱副产物代谢途径相结合的方式,强化了L-缬氨酸合成前体丙酮酸的供给;其次,针对L-缬氨酸合成路径关键酶—乙酰羟酸合酶进行定点突变,提高了菌株的抗反馈抑制能力,并利用启动子工程策略,优化了路径关键酶的基因表达水平;最后,利用辅因子工程策略,改变了乙酰羟酸还原异构酶和支链氨基酸转氨酶的辅因子偏好性,由偏好NADPH转变为偏好NADH,从而提高了L-缬氨酸的合成能力。在5L发酵罐中,最优谷氨酸棒杆菌工程菌株Corynebacterium glutamicum K020的L-缬氨酸产量、得率和生产强度分别达到了110g/L、0.51g/g和2.29 g/(L·h)。     

Nonparametric and semiparametric estimation with sequentially truncated survival data

In observational cohort studies with complex sampling schemes, truncation arises when the time to event of interest is observed only when it falls below or exceeds another random time, that is, the truncation time. In more complex settings, observation may require a particular ordering of event times; we refer to this as sequential truncation. Estimators of the event time distribution have been developed for simple left-truncated or right-truncated data. However, these estimators may be inconsistent under sequential truncation. We propose nonparametric and semiparametric maximum likelihood estimators for the distribution of the event time of interest in the presence of sequential truncation, under two truncation models. We show the equivalence of an inverse probability weighted estimator and a product limit estimator under one of these models. We study the large sample properties of the proposed estimators and derive their asymptotic variance estimators. We evaluate the proposed methods through simulation studies and apply the methods to an Alzheimer's disease study. We have developed an R package, seqTrun , for implementation of our method.