Photosan脂质立方液晶纳米光敏剂的制备及光动力杀伤效应研究

目的:制备Photosan脂质立方液晶纳米光敏剂,通过体外实验探讨其介导的光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)特异性杀伤肿瘤细胞效果。方法:以单油酸甘油酯(glyceryl monooleate,GMO)和泊洛沙姆407(poloxamer 407,P407)为液晶材料,以光敏剂Photosan为模型药物,制备Photosan立方液晶纳米粒,通过Malvern粒径仪和扫描电子显微镜等考察其理化性质;通过MTS法考察Photosan立方液晶纳米粒对正常肝细胞株和肝癌细胞株的暗毒性及光动力杀伤效果。结果:成功制备Photosan脂质立方液晶纳米粒,该纳米粒对人肝L-02细胞和人肝癌Hep G2细胞均没有暗毒性,其介导的PDT对人肝L-02细胞增殖有一定抑制作用[细胞抑制率为(32.9±1.19)%],而对肝癌Hep G2细胞增殖具有更显著的抑制作用[细胞抑制率为(77.9±2.06)%];Photosan立方液晶介导的光动力作用对人正常肝细胞的增殖抑制作用低于Photosan,但对肝癌细胞的增殖抑制作用高于Photosan。结论:Photosan脂质立方液晶纳米粒对人正常肝细胞安全性较好,对肝癌细胞的光动力杀伤效应明显优于Photosan,为光动力治疗癌症提供了创新性方法。     

重楼活性单体pp-10通过抑制PI3K/Akt通路诱导人胃癌细胞BGC-823凋亡和自噬

目的:探讨重楼/七叶一枝花(Paris polyphylla)的醇提物单体pp-10诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡和自噬及其分子机制。方法:采用MTT法和克隆形成抑制实验观察不同浓度的重楼单体pp-10对人胃癌BGC-823细胞的增殖抑制作用;Hoechst33342染色法检测pp-10作用于人胃癌BGC-823细胞后细胞核形态的改变;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;Western blotting检测重楼单体pp-10对细胞凋亡和自噬相关蛋白Caspase-3、Caspase-9、(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、Bax、Bcl-2、LC3、P62以及PI3K/Akt信号通路相关蛋白(Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR、P70s6k、p-P70s6k)表达的影响。结果:重楼单体pp-10能显著抑制BGC-823细胞的生长,作用呈时间-效应关系及剂量-效应关系;克隆形成抑制实验表明随着pp-10浓度的增加,细胞克隆形成逐渐减少,与对照组相比有显著差异;在荧光显微镜下观察可见其细胞核固缩、边聚、裂解等细胞凋亡形态学变化;流式细胞术检测显示,随着作用药物浓度的增高,其凋亡率逐渐升高;Western blotting结果表明,随着药物浓度的增加,线粒体相关凋亡信号通路蛋白Caspase9、Caspase3及PARP均出现酶切活化条带,细胞促凋亡蛋白Bax的表达水平增加,抗凋亡蛋白Bcl-2减少,自噬相关蛋白Ⅱ型LC3增加,P62蛋白减少,p-Akt蛋白的表达水平下降,Akt下游蛋白p-m Tor、p-p70S6K表达减少。结论:重楼单体pp-10通过抑制BGC-823细胞增殖,诱导细胞凋亡和自噬,与下调P13K/Akt信号通路有关。     

增强型肿瘤特异性启动子介导CDTK治疗肝癌的体内外研究

目的:探讨运用增强子上调肿瘤特异性启动子h TERT转录活性后,调控自杀融合基因CDTK对人肝癌细胞系Bel-7402的体内外杀伤作用。方法:将CMV增强子、h TERT启动子及CDTK自杀融合基因克隆入核糖体基因区打靶载体p Hrn,构建p Hr-Ce Tp CDTK-GFP治疗载体并转染Bel-7402细胞,经RT-PCR、HPLC、MTT检测CDTK基因的表达和对肝癌细胞的体外杀伤效果。再将Bel-7402细胞接种到裸鼠皮下致瘤,以肿瘤杀伤载体p Hr-Ce Tp CDTK-GFP进行瘤内转染并检测其抑瘤效果,此外将转染后的细胞接种致瘤,检测其成瘤时间及肿瘤生长曲线等,从两方面检测其体内杀伤效果。结果:成功构建了肿瘤特异性治疗载体,体外转染肝癌细胞后,经RTPCR、HPLC证明CDTK基因能在肝癌中表达,且治疗载体在体外对肝癌细胞有明显毒性。动物实验结果发现裸鼠致瘤后治疗组血清中5-Fu浓度为7.694μg/ml,治疗组肿瘤体积与对照组相比减小6.5倍。而细胞转染治疗载体后致瘤,治疗组成瘤时间比对照组晚8天,且治疗组裸鼠的平均生存期较对照组延长16天。结论:p Hr-Ce Tp CDTK-GFP载体能在体内外高效靶向杀伤肝癌细胞,为肝癌基因治疗提供了一种新的途径。     

HBV pre-c-Fc融合蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其生物学活性研究

目的:在杆状病毒表达系统中表达融合蛋白乙型肝炎病毒前C蛋白-小鼠IgG Fc蛋白(HBV precore protein-mouse IgG Fc,HBV pre-c-Fc),并鉴定其免疫原性。方法:目的基因HBV prec-Fc连接到pFastBac1载体,获得的pFastBac1-HBV pre-c-Fc质粒转化DH10Bac感受态,通过Tn7转座子将目的基因转座到Bacmid中,得到Bacmid-HBV pre-c-Fc穿梭载体,脂质体包被后转染Sf9昆虫细胞获得P1代病毒,重复转染Sf9获得高滴度病毒。收集细胞上清超滤后通过Protein G亲和层析柱纯化得到目的蛋白HBV pre-c-Fc。纯化的蛋白大腿内侧肌肉注射免疫BALB/c小鼠并检测血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗体产生量。结果:HBV pre-c-Fc在昆虫细胞中成功表达,纯化后蛋白纯度达90%以上,蛋白产量约为3.03mg/L,纯化蛋白能有效刺激BALB/c小鼠产生特异抗体。结论:成功地在杆状病毒表达系统中表达了具有免疫原性的HBV pre-c-Fc蛋白,为生产乙肝治疗性疫苗奠定了基础。     

MUC1对人结肠癌细胞HCT116生物学行为的影响

目的:观察MUC1对人结肠癌细胞HCT116增殖、侵袭及化疗敏感性的影响。方法:采用MUC1表达阴性的结肠癌细胞株HCT116,通过慢病毒转染、嘌呤霉素筛选、半定量RT-PCR和Western blot鉴定构建稳定表达MUC1的HCT116细胞株;实验分空病毒组和MUC1病毒组;CCK实验和软琼脂克隆形成实验检测两组细胞的增殖能力,Transwell侵袭实验检测两组细胞的侵袭能力;MTT法和流式细胞仪检测两组细胞对奥沙利铂的敏感性,酶底物法检测Caspase-3活性。结果:获得稳定表达MUC1的HCT116细胞株;两组细胞贴壁生长无差异;与空病毒组相比,MUC1病毒组细胞软克隆形成数增加,穿过小室的细胞数增加(P0.05);MUC1病毒组细胞对奥沙利铂的敏感性降低,MUC1病毒组Caspase-3活性水平低于空病毒组(P0.05)。结论:MUC1与结肠癌的非锚定依赖生长、侵袭和化疗敏感性有关。     

多靶向RNA干扰技术在基因治疗中的应用与前景

RNA干扰(RNA interference,RNAi)通过转录后基因沉默效应特异性抑制靶基因的表达,其沉默机制的高效性、特异性及稳定性使这项技术成为生物医学领域研究基因治疗的重要工具。阐述RNAi技术的特点和RNAi疗法的现状,特别是多靶小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)目前的发展态势及其各种结构性修饰,通过使用这些结构修饰的siRNA提高基因沉默的效率,将有助于提高疗效。但该技术在广泛应用于临床之前,仍存在一些亟待解决的问题与面临的挑战,需进一步研究。     

基于Loxp-Cre系统的FBXL15基因敲除小鼠模型的建立

建立FBXL15基因条件型敲除小鼠模型,为研究该基因所发挥的重要生理功能提供材料和思路。采用KO first策略,构建打靶载体,将1st loxP插入1~2号内含子,在3~4号内含子之间插入FRT-SAIRES-lacZ-loxP-neo-loxP元件,通过Long Range PCR及Southern blot筛选出中靶克隆,随后进行囊胚注射,并将发生同源重组的ES细胞注射进C57BL/6J小鼠囊胚,移入受体小鼠子宫,最后将得到的嵌合体雄鼠与C57BL/6J雌鼠交配获得FBXL15-LoxP小鼠。PCR结果显示FBXL15的Loxp小鼠模型构建成功,该模型可为进一步研究FBXL15在胚胎发育和骨代谢中的调控作用提供工具。     

在大肠杆菌中表达酮酸脱羧酶产异戊醇

酮酸脱羧酶作为异戊醇生物合成的关键酶,不存在于大肠杆菌中。以乳酸乳球菌的基因组DNA为模板,经过PCR扩增得到酮酸脱羧酶基因kivD(rbs),插入到大肠杆菌高效表达载体pET-28a(+)上形成pET-kivD(rbs),重组质粒热击转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,其成功表达了酮酸脱羧酶。对发酵产物进行分析,检测到了微量的目标产物—异戊醇。     

基于DUS测试的上海粳稻地方品种遗传多样性分析

利用水稻DUS测试指南(2012版)中的38个水稻标准品种和52个基本测试性状对上海地区的172个粳稻地方品种进行遗传多样性分析,并与14个上海地区选育的申请品种保护的粳稻品种作比较。结果表明:地方品种表型性状共检测到176个等位变异,平均每个测试性状检测到3.6667个,变幅介于1~8个。Shannon's多样性指数(H')平均值为0.6834,变幅介于0~1.9327,77.08%的性状存在3个及以上的等位变异;地方品种的等位变异数、每个性状的等位变异数及其变异幅度、多样性指数平均值等均大于现代育成品种,在外观形态上,地方品种的遗传多样性比现代育成品种更丰富。利用UPGMA法进行聚类分析发现在相似系数为0.53时,可将186个粳稻品种分为3个类(亚)群,现代育成品种单独组成一个亚群;而主坐标分析将186个粳稻品种明显的分为地方品种和现代育成品种两大区。地方品种具有丰富的多样性,与现代育成品种具有明显的形态差异,可为今后粳稻育成品种的改良提供更多的形态基础。     

小鼠和大鼠的胚胎培养基及若干相关问题

哺乳动物早期胚胎体外培养所用各种化学成份明确的培养基是研究生命科学中一项重要技术。它已被常规用于研究胚胎早期发育,多种动物及人类辅助生殖技术,转基因动物,动物克隆等领域。介绍了用于移植前胚胎培养基的研究和发展历史,当前所用化学成份明确胚胎培养基的主要组成,特别是针对小鼠和大鼠移植前胚胎所用各种培养基及其成份,讨论了这类培养基发展前景和研究方向。