利用CRISPR/Cas9技术构建稳定表达人白蛋白基因的中国仓鼠卵巢细胞系

通过目的基因的随机整合方式,构建得到的CHO表达细胞系,常会因为目的基因插入到染色体内不稳定区域,而在长期传代过程中出现表达不稳定的现象,这主要是由于位点效应所导致的。为了解决这个问题,现利用CRISPR/Cas9技术介导的同源重组,将目的基因直接整合于CHO细胞染色体上的稳定表达区域,以克服位点效应带来的CHO表达细胞系的长期表达不稳定。利用该技术总共获得了2株外源基因(人白蛋白基因)定点整合细胞系; Western blot结果显示,细胞上清液的产物具有人白蛋白抗原性;细胞在贴壁状态下,两株细胞系在第3、12、23、35、50代,细胞每日表达的HSA质量接近,且均维持在0. 5pg cell/d;选取一株表达细胞系,经悬浮驯化后,在批次条件培养下,第1、25、50代的悬浮细胞,在摇瓶内的表达浓度均稳定在13～14mg/L。显示了将外源基因定点整合于CHO细胞基因组内的可行性;且外源基因整合在稳定表达区域后,重组细胞系具有对外源基因长期表达的稳定性。     

从人胃肠道源乳杆菌株中初步筛选耐酸耐胆盐优良株

目的筛选对酸和胆盐耐受性均较强的优良乳杆菌株。方法模拟人体胃酸环境（pH=3）和十二指肠高胆盐环境（胆盐含量=3‰）测定104株人胃肠道源乳杆菌在酸性及高胆盐环境下作用4h后的存活菌数,并与对照相比较。对结果进行统计学分析。结果16株菌在酸性环境及高胆盐环境下4h后的活菌下降对数值均小于2。筛选出3株具有较强耐酸耐胆盐能力的乳杆菌株。结论大多数人胃肠道源乳杆菌对酸和胆盐的耐受能力均不强,对酸的耐受性普遍强于对胆盐的耐受性。     

不同施肥处理对'秦美'猕猴桃贮藏性及其品质的影响

以秦美猕猴桃为材料,对不同施肥处理的果实后熟过程中软化、腐化过程进行观察统计,并在果实采后4个具有代表性的后熟时期(硬度分别为15 kg/cm2左右、8~7 kg/cm26、~5 kg/cm25、~4 kg/cm2)进行可溶性固形物、可滴定酸、Vc、可溶性糖等营养指标测定.结果显示:(1)从后熟过程中软化、腐化统计看,3个施肥处理(A、B、C)的贮藏品质与对照(CK)间差异明显,C处理(氮肥 磷肥 农家肥)的猕猴桃贮藏期最长,软化、腐化出现得最晚,较对照分别延长15 d、27 d,贮藏性最好;(2)3个施肥处理的营养指标与CK间差异明显,C处理与CK和A处理差异显著.表明在猕猴桃生产中采用氮肥 磷肥 农家肥相结合的施肥方式可显著延长猕猴桃果实贮藏期(后熟期),并可显著提高猕猴桃果实的食用和营养品质.     

抗微生物脂肽体外抗PRV和PPV的研究

本试验研究了枯草芽孢杆菌fmbJ株产生的抗微生物脂肽(Antimicrobiallipopeptide,AMI)的体外抗伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)、猪细小病毒(Porcineparvovirus,PPV)南京株活性并对其可能的机理进行了初步探讨。结果表明该抗微生物脂肽对猪肾(PorcineKidney,PK-15)细胞的半数中毒浓度(MedianToxicosisDose,TD50)和最大无毒浓度(TD0)分别为47.57mg/L、18.9mg/L;对PRV株、PPV南京株所致细胞病变效应(CytopathicEffects,CPE)有明显的抑制作用,可使细胞存活率显著升高;但不能抑制PRV株、PPV南京株在PK-15细胞上的感染和复制。由此可知,该抗微生物脂肽可以直接作用于PRV株、PPV南京株,从而抑制其对PK-15细胞的感染作用,其作用效果显著低于抗病毒药物阿昔洛韦(Acyclovir,ACV),但由于其对PK-15细胞毒性较弱,可作为一种抗病毒药物进行进一步开发研究。     

ICAM-1及其受体在高致病性禽流感病毒性肺炎中的作用研究

本文应用高致病性禽流感病毒性肺炎(Highlypathogenicavianinfluenzaviralpneumonia,HPAIVP)小鼠模型,采用免疫组织化学染色方法,对实验组和对照组小鼠肺组织中ICAM-1及其受体的表达含量进行检测。研究发现:实验组小鼠肺组织中ICAM-1及其受体表达含量在攻毒后1d即开始升高,第4天达高峰。就攻毒剂量来说,以100LD50/50μL攻毒组小鼠肺组织中ICAM-1及其受体阳性表达量升高最明显。并通过ELASA方法进一步证实了这种变化。结果表明:ICAM-1及其受体在HPAIVP中呈现高表达,可能在其发病中发挥了重要作用。     

虎源H5N1亚型禽流感病毒感染小鼠模型的建立

为研究H5N1亚型禽流感病毒的病原特性、致病机理及对其疫苗与救治药物效果评价提供平台,利用本室分离鉴定的虎源A/Tiger/Harbin/01/2002株(简称HAB/01)H5N1亚型禽流感病毒进行连续10倍稀释后,对4～6周龄雄性BALB/c小鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒,每个稀释度接种10只实验小鼠,测定其MLD50,检测小鼠感染、致病的多项指标,观察期为14d。结果感染小鼠呈现出规律的以肺炎为主的临床症状、病理变化及病死率;测得该病毒对小鼠的MLD50为10-7.1/0.05mL。成功建立了虎源H5N1亚型禽流感病毒感染BALB/c小鼠的实验模型。     

Plantaricin 163对热杀索丝菌的抗菌活性及其作用机制

【背景】热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta)为鲫鱼在4°C贮藏过程中的主要腐败菌,Plantaricin 163是由植物乳杆菌产生的一种新型广谱细菌素,能明显延长鲫鱼的贮藏期。【目的】研究Plantaricin163对热杀索丝菌的抗菌活性和作用机制。【方法】通过测定最小抑菌浓度(Minimuminhibitoryconcentration)和杀菌动力学了解Plantaricin163对热杀索丝菌的抗菌效果,并从电导率的变化、核酸和蛋白的泄露、流式细胞实验、扫描电镜和透射电镜观察等4个方面探讨Plantaricin 163对热杀索丝菌的作用机制。【结果】Plantaricin 163对热杀索丝菌的的最小抑菌浓度为32μg/mL,优于Nisin的作用效果,作用方式为杀菌模式,6 h内能完全杀死热杀索丝菌。Plantaricin163能够通过增加热杀索丝菌细胞膜的通透性,增加胞外电导率,进而破坏细胞膜完整性,导致内容物泄漏,并影响细胞的外部形态和内部结构,从而导致菌体细胞瓦解死亡。【结论】Plantaricin 163可以破坏热杀索丝菌的细胞膜和内部结构,发挥抗菌活性。     

犬瘟热病毒核蛋白基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达

核蛋白基因(N)位于犬瘟热病毒基因组的108—1679位置处,是保守性较强的免疫原性蛋白,因此选择N基因作为目的基因,利用酶切、连接等方法构建了含犬瘟热病毒核蛋白基因的穿梭质粒pVAX?E3LPN。以含CAV-2SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建了重组质粒pCAV-2-CDVLPN,利用脂质体介导法转染MDCK细胞,转染三次后,细胞出现了典型的腺病毒样病变。电镜负染、切片观察,酶切、PCR扩增及测序鉴定的结果表明表达犬瘟热核蛋白基因的重组犬2型腺病毒构建成功,表达的核蛋白分子量为58kDa。     

水土保持林恢复土壤可溶性碳氮组分动态与三维荧光特征分析

为探究水土保持林恢复过程中土壤可溶性碳氮含量变化及其有机组成特性,揭示水保林土壤固存可溶性有机质的效应及机制。选取了黄土丘陵区恢复12-45a的人工柠条、刺槐林以及撂荒地,分析了土壤可溶性碳氮含量及其三维荧光光谱特征与特性参数的动态变化。结果表明：随恢复年限的增加,3种植被土壤可溶性有机碳（DOC）、有机氮（DON）、无机氮（DIN）的含量均呈增加趋势,并且相同恢复年限下DOC、DON、DIN含量总体表现为撂荒 < 柠条 < 刺槐;但柠条和刺槐林土壤DOC：DON及二者占总有机碳、全氮比例并未持续增加,到恢复45a时DOC占总有机碳比例以及DOC：DON均以撂荒地最高,刺槐林最低,DON占全氮比例则表现相反。三维荧光结合平行因子分析得出所有样地土壤可溶性有机质（DOM）主要有大分子腐殖物质（C1）、低分子量类富里酸（C2）、类色氨酸（C3）及农业措施输入的腐殖物质（C4）4个组分,并且以C1组分占比最大,平均达37.4%。随恢复年限增加,3种植被土壤DOM中C3组分占比升高,C2和C4组分占比降低,C1组分占比在柠条和刺槐林中升高,在撂荒地中则降低。不同植被土壤可溶性有机质荧光指数（FI）、新鲜度指数（β：α）及自生源指数（BIX）差异不显著,分别为1.63、0.58、0.59;不同恢复年限撂荒地腐殖化指数（HIX）没有差异,但柠条和刺槐林显著高于撂荒且随恢复年限增加先增大后稳定。综上,水保林持续恢复可以显著提升土壤可溶性碳氮含量,也使土壤可溶有机质组成趋向复杂和相对稳定,利于累积固持,特别以刺槐林效应最明显。     

高原鼢鼠肉营养成分分析及评价

通过对高原鼢鼠（Myospalax baileyi）肉质进行营养成分的分析,评价其营养价值。测定了高原鼢鼠肉的水分、灰分、蛋白质、粗脂肪、微量元素、脂肪酸、氨基酸与维生素的含量。结果表明,高原鼢鼠肉中含丰富的蛋白质（18．7％）、氨基酸种类齐全（含17种氨基酸,8种人体必需氨基酸俱全）、脂肪酸以不饱和脂肪酸为主（占总脂肪酸的64．14％）、VE含量高,并含有一般动物肉中没有的VC,含有多种微量元素,微量元素含量具有明显的高K低Na等特点,符合现代营养保健趋势,可作为低钠营养保健品资源开发。