大肠杆菌基因无痕敲除技术及策略

基因敲除技术是大肠杆菌基因组减小和代谢途径改造的有效手段,其中基于同源重组原理的基因无痕敲除技术显现出其他技术所不具备的应用优势和发展潜力。该技术可以快速敲除大肠杆菌基因组中的目标基因,并且在基因组中不残留任何外源片段,所以不会干扰后续的基因操作。我们分类介绍了无痕敲除技术中所涉及载体的结构、功能及其相应的敲除策略,着重介绍了无痕敲除技术的原理及载体构建方法。     

高赖氨酸蛋白基因在大肠埃希菌中的表达

从四棱豆中克隆高赖氨酸蛋白基因wblys,通过PCR扩增wblys片段,转入原核表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-4T-1/wblys大肠埃希菌工程菌,表达重组蛋白,IPTG诱导后,发现细菌全蛋白在44 ku(含GST标签)处多出1条明显条带。HPLC检测赖氨酸含量。诱导后菌体总赖氨酸含量比正常菌体提高15.84 mg/g。在大肠埃希菌中高效表达植物源高赖氨酸蛋白基因,为该基因在益生菌中表达提供研究工作基础。     

中国野生的香根草种及其保护与分类问题

香根草(Vetiveria zizanioides)这一优良的水土保持和多用途植物目前在热带和亚热带地区广泛推广应用。中国的香根草栽培种主要是在50年代从国外引进的,但在广东和海南也有这一植物的野生种存在,尤其在广东的吴川有一块面积达6670 hm²左右的野生香根草群落。然而,由于人类活动的影响和过度开发利用,40年间,这片热带草原已遭到严重破坏,面积和蕴藏量都大幅度减少。为了不使这片珍贵的湿地消失殆尽,必须尽快采取措施加以保护。另外,香根草属的系统分类还很不完善,上述在中国分布的野生居群究竟是香根草还是野香根草(V. nigritana),迄今还没有定论,经对标本的研究鉴定,初步确定为香根草(Vetiveria zizanioides）。     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段在Pichia pastoris中的表达

伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白E是一种在伪狂犬病根除计划中具有重要作用的糖蛋白.将伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段克隆到巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPICZαA中,获得的重组表达载体pPICZαA-FL电击转化野生型酵母菌SMD1168后,得到多株酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL.经高浓度Zeocin^TM筛选、表型鉴定、工程菌的诱导表达及表达产物的鉴定,最后得到高效表达gE基因去信号肽片段的酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL-7.工程菌72 h培养上清的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质印迹结果显示,gE基因去信号肽片段表达产物大小约为80 ku,比预期的63.8 ku大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的13.49%,表达量可达11.7 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分伪狂犬病病毒gE标准阳性与阴性血清.     

北方寒冷干旱地区内陆湖泊生态安全评价指标体系研究——以呼伦湖为例

呼伦湖作为我国北方寒冷干旱地区内陆湖泊的典型代表,在涵养水源、调节气候、防风固沙及维系呼伦贝尔草原生态系统平衡乃至我国北方生态安全屏障等方面发挥着不可替代的作用。准确识别呼伦湖流域主要生态安全问题、完善其生态安全评价指标体系对于科学研判呼伦湖生态环境状况、维持区域可持续发展及精准实施底线管控政策具有重要意义。在遥感影像、地面调查、实验模拟等多尺度数据分析基础上,结合历史资料收集、专家咨询、部门访谈等方式分析识别了呼伦湖区域生态安全问题及成因：（1）气候暖干化及超载放牧等因素使得草地退化显著,土地沙化、盐碱化面积扩大;（2）草原退化增加了干草入湖、大气干湿沉降及水土流失等水环境污染负荷;（3）气候暖干化造成湿地萎缩,加之长期的过度捕捞等人类活动使得渔业资源枯竭、鱼类小型化特征显著,水生生态系统稳定性下降,蓝藻水华频发。在全面诊断分析区域生态安全问题的基础上,以山水林田湖草系统方法论为理论指导,以改善呼伦湖流域生态环境质量为核心目标,依据评价指标的针对性、科学性、可操作性及系统性原则,采用压力-状态-响应（Pressure-State-Response,PSR）模型,以气象条件、人口、水资源、水环境压力及人类活动等5个一级指标构成的压力子系统,以水环境状况、水生态状况、陆域生态状况、生态系统服务功能和敏感性、景观格局及生态风险等6个指标构成的状态子系统,以生态治理措施及生态治理投入等2个指标构成的响应子系统,共同组成了一套包含13个一级指标38个二级指标的天空地一体、陆湖统筹的生态安全评价指标体系,以期为呼伦湖及北方寒冷干旱区类似湖泊的生态安全评价研究提供借鉴。     

1株拮抗真菌的生防细菌Xj11的分离与鉴定

从江西省井冈山自然保护区发病毛竹中分离到1株具有明显抑制植物病原真菌活性的生防细菌Xj11。其对小麦赤霉病菌、尖孢镰刀菌、甘蔗节菱孢菌、链格孢菌和炭角菌均有较强的抑制作用。通过形态特征和培养特征观察、生理生化实验及16S rDNA序列系统发育分析,初步鉴定该菌为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌,命名为Burkholderia gladioli strain Xj11。     

松口蘑深层发酵工艺的研究

对松口蘑深层发酵工艺进行系统研究。通过正交试验初步确定松口蘑适宜的培养基组成 :玉米粉 30g,葡萄糖 1 0g ,豆饼粉 1 0g ,玉米浆 1 0g ,KH₂ PO₄1g ,定容至 1L。适宜发酵条件 :最适生长温度为 2 5℃ ,摇瓶转速为 1 60r/min ,最适pH为 5 0 ,最适接种量为 1 0 % ,装液量 1 2 0mL/ 5 0 0mL摇瓶培养 1 0d ,菌体生物量达 1 2 94g/L。     

醇母PHO81基因的克隆和表达

从酵母染色体ＤＮＡ中获得１个约３．０ｋｂ的ＢａｍＨＩ的克隆片段和１个约５．０ｋｂ的ＰｓｔＩ片段,前者包含１７４５ｂｐ的ＰＨＯ８１基因编码序列及１２４４ｂｐ的上游序列,后者包含２２３６ｂｐ的编码序列及约２．８ｋｂ的下游序列,经拼接得到完整的ＰＨＯ８１基因。以ＵＲＡ３基因取代部分ＰＨＯ８１的编码序列,通过体内同源重组,获得ＰＨＯ８１基因缺陷的酵母细胞株。构建ＰＨＯ８１－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷酶的活力表示ＰＨＯ８１基因的表达水平,研究了它的表达作用。ＰＨＯ８１基因为阻遏型表达,受无机磷浓度的控制,高磷使基因表达阻遏,低磷去阻遏。ＰＨＯ８１对其自身的表达有正调控作用,它与ＰＨＯ５和ＰＨＯ１１基因的调控模式相似,但ＰＨＯ８１上游调控序列和ＰＨＯ５及ＰＨＯ１１的同源性很低。     

mRNA差异显示技术中特异条带回收方法的比较

目的：建立简化的mRNA差异显示技术中特异条带的回收方法。方法：用单个小鼠早期发育的胚胎构建mRNA差异显示技术,用一步法和煮沸法分别从银染的聚丙烯酰胺凝胶中回收差异显示的特异条带,并进行再扩增、回收、克隆及酶切鉴定。结果：两种不同的回收方法经过mRNA差异显示技术程序环节,证明其具有相同的实验效果。结论：应用简化的一步法和煮沸法对单胚构建的mRNA差异显示技术中的特异条带进行回收,具有有效性和可靠性。     

沙地不同发育阶段的人工生物结皮对重金属的富集作用

生物结皮广泛存在于沙地生态系统,具有重要的生态功能.通过对位于库布齐沙漠腹地达拉特旗火力发电厂附近沙地中不同年代人工生物结皮及物理结皮中重金属含量的测定,旨在分析不同类型生物结皮及物理结皮在不同的发育阶段对重金属富集的影响和重金属污染的指示程度.通过分析和比较,得出以下结论:不同年代生物结皮和物理结皮各种重金属含量均表现为随着发育时间的增加而增加的趋势,生物结皮重金属含量多数类型表现为:Zn＞Cr＞Ni＞Pb＞Cu＞As＞Co＞Cd＞Hg的顺序关系,少数类型表现为:Cr＞Zn＞Ni＞Pb＞Cu＞As＞Co＞Cd＞Hg的顺序关系.通过单因素方差分析(ANOVA),不同年代藓结皮中各种元素差异显著性(P＜0.05)明显低于藻结皮和物理结皮.相同年代生物结皮和物理结皮重金属含量都表现为同样地规律:藓结皮＞藻结皮＞物理结皮,表明相同背景条件下,藓结皮对各种重金属的富集能力明显比藻结皮和物理结皮的富集能力强.通过单因素方差分析(ANOVA),Hg和Ni元素含量在所有相同年代样地的生物结皮和物理结皮均无差异,Cr、Zn、Cu、Co元素含量均存在差异(P＜0.05),但差异有的表现在藓结皮和藻结皮之间,而有的表现为藻结皮和物理结皮之间,而Pb、As、Cd元素含量则表现为有的年代有差异,有的年代无差异.通过污染因子CF值分析,藓结皮对污染的指示作用要明显比藻结皮和物理结皮敏感.同时生物结皮对于重金属的富集具有一定的选择性,像Hg、Ni、Zn、Cu、Pb、Co等元素生物结皮相对富集较少,而像Cr、Cd、As等元素相对富集较多.