mRNA差异显示技术中特异条带回收方法的比较

目的：建立简化的mRNA差异显示技术中特异条带的回收方法。方法：用单个小鼠早期发育的胚胎构建mRNA差异显示技术,用一步法和煮沸法分别从银染的聚丙烯酰胺凝胶中回收差异显示的特异条带,并进行再扩增、回收、克隆及酶切鉴定。结果：两种不同的回收方法经过mRNA差异显示技术程序环节,证明其具有相同的实验效果。结论：应用简化的一步法和煮沸法对单胚构建的mRNA差异显示技术中的特异条带进行回收,具有有效性和可靠性。     

大肠杆菌基因无痕敲除技术及策略

基因敲除技术是大肠杆菌基因组减小和代谢途径改造的有效手段,其中基于同源重组原理的基因无痕敲除技术显现出其他技术所不具备的应用优势和发展潜力。该技术可以快速敲除大肠杆菌基因组中的目标基因,并且在基因组中不残留任何外源片段,所以不会干扰后续的基因操作。我们分类介绍了无痕敲除技术中所涉及载体的结构、功能及其相应的敲除策略,着重介绍了无痕敲除技术的原理及载体构建方法。     

1株拮抗真菌的生防细菌Xj11的分离与鉴定

从江西省井冈山自然保护区发病毛竹中分离到1株具有明显抑制植物病原真菌活性的生防细菌Xj11。其对小麦赤霉病菌、尖孢镰刀菌、甘蔗节菱孢菌、链格孢菌和炭角菌均有较强的抑制作用。通过形态特征和培养特征观察、生理生化实验及16S rDNA序列系统发育分析,初步鉴定该菌为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌,命名为Burkholderia gladioli strain Xj11。     

醇母PHO81基因的克隆和表达

从酵母染色体ＤＮＡ中获得１个约３．０ｋｂ的ＢａｍＨＩ的克隆片段和１个约５．０ｋｂ的ＰｓｔＩ片段,前者包含１７４５ｂｐ的ＰＨＯ８１基因编码序列及１２４４ｂｐ的上游序列,后者包含２２３６ｂｐ的编码序列及约２．８ｋｂ的下游序列,经拼接得到完整的ＰＨＯ８１基因。以ＵＲＡ３基因取代部分ＰＨＯ８１的编码序列,通过体内同源重组,获得ＰＨＯ８１基因缺陷的酵母细胞株。构建ＰＨＯ８１－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷酶的活力表示ＰＨＯ８１基因的表达水平,研究了它的表达作用。ＰＨＯ８１基因为阻遏型表达,受无机磷浓度的控制,高磷使基因表达阻遏,低磷去阻遏。ＰＨＯ８１对其自身的表达有正调控作用,它与ＰＨＯ５和ＰＨＯ１１基因的调控模式相似,但ＰＨＯ８１上游调控序列和ＰＨＯ５及ＰＨＯ１１的同源性很低。     

松口蘑深层发酵工艺的研究

对松口蘑深层发酵工艺进行系统研究。通过正交试验初步确定松口蘑适宜的培养基组成 :玉米粉 30g,葡萄糖 1 0g ,豆饼粉 1 0g ,玉米浆 1 0g ,KH₂ PO₄1g ,定容至 1L。适宜发酵条件 :最适生长温度为 2 5℃ ,摇瓶转速为 1 60r/min ,最适pH为 5 0 ,最适接种量为 1 0 % ,装液量 1 2 0mL/ 5 0 0mL摇瓶培养 1 0d ,菌体生物量达 1 2 94g/L。     

中国野生的香根草种及其保护与分类问题

香根草(Vetiveria zizanioides)这一优良的水土保持和多用途植物目前在热带和亚热带地区广泛推广应用。中国的香根草栽培种主要是在50年代从国外引进的,但在广东和海南也有这一植物的野生种存在,尤其在广东的吴川有一块面积达6670 hm²左右的野生香根草群落。然而,由于人类活动的影响和过度开发利用,40年间,这片热带草原已遭到严重破坏,面积和蕴藏量都大幅度减少。为了不使这片珍贵的湿地消失殆尽,必须尽快采取措施加以保护。另外,香根草属的系统分类还很不完善,上述在中国分布的野生居群究竟是香根草还是野香根草(V. nigritana),迄今还没有定论,经对标本的研究鉴定,初步确定为香根草(Vetiveria zizanioides）。     

响应面法优化灰霉病生防菌CNY-04培养条件

【目的】通过优化生防菌CNY-04的培养条件,提高其对灰霉病菌的抑菌效果。【方法】在单因素试验的基础上,利用响应面法(Response surface methodology)对灰霉病生防菌CNY-04培养条件进行整体优化,并测其生长曲线。【结果】生防菌CNY-04最优培养条件为牛肉膏0.5%、蛋白胨2.0%、酵母膏0.1%、葡萄糖0.5%、时间48 h、接种量4%、温度32°C、pH 8.0、装液量75 mL/250 mL和转速150 r/min,在此培养条件下生防菌CNY-04的OD600为2.907,与模型预测值相符,对灰葡萄孢菌的抑菌圈直径为44.5 mm,较优化前提高了30.9%。【结论】从整体上确定了生防菌CNY-04的最优培养条件,为该菌扩大化生产提供理论基础。     

MC 3T3-E1细胞在纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合支架上的增殖和分化

用原位合成纳米羟基磷灰石的方法制备多孔纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合支架;在支架上接种MC 3T3-E1细胞,瑞氏染色检测细胞形态,MTT法检测其增殖情况;在诱导培养基中培养30d后,碱性磷酸酶染色比较其分化水平;定量检测细胞的碱性磷酸酶活性;RT-PCR检测成骨相关基因的表达情况。实验结果表明：MC 3T3-E1细胞在纳米级羟基磷灰石/壳聚糖复合支架上粘附铺展良好,其增殖率显著高于培养于纯壳聚糖支架上的细胞。碱性磷酸酶染色表明复合支架上的细胞有较高水平的碱性磷酸酶表达。进一步定量检测细胞的碱性磷酸酶活性,结果说明在复合支架上细胞比纯壳聚糖支架上培养的细胞碱性磷酸酶活性提高了约8倍。此外,骨分化相关特征基因骨桥蛋白OPN在复合支架上培养的细胞中的表达水平也明显高于纯壳聚糖上培养的细胞。分化成熟标志基因骨钙素OC在复合支架上培养的细胞中有表达,但是纯壳聚糖支架上培养的细胞中却未检测到。支架中纳米羟基磷灰石的加入不仅提高了前成骨细胞在复合支架上的增殖,而且还促进了它的分化。纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合支架表现出良好的生物相容性和生物活性,是极具前景的骨组织工程支架材料。     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段在Pichia pastoris中的表达

伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白E是一种在伪狂犬病根除计划中具有重要作用的糖蛋白.将伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段克隆到巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPICZαA中,获得的重组表达载体pPICZαA-FL电击转化野生型酵母菌SMD1168后,得到多株酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL.经高浓度Zeocin^TM筛选、表型鉴定、工程菌的诱导表达及表达产物的鉴定,最后得到高效表达gE基因去信号肽片段的酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL-7.工程菌72 h培养上清的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质印迹结果显示,gE基因去信号肽片段表达产物大小约为80 ku,比预期的63.8 ku大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的13.49%,表达量可达11.7 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分伪狂犬病病毒gE标准阳性与阴性血清.     

高赖氨酸蛋白基因在大肠埃希菌中的表达

从四棱豆中克隆高赖氨酸蛋白基因wblys,通过PCR扩增wblys片段,转入原核表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-4T-1/wblys大肠埃希菌工程菌,表达重组蛋白,IPTG诱导后,发现细菌全蛋白在44 ku(含GST标签)处多出1条明显条带。HPLC检测赖氨酸含量。诱导后菌体总赖氨酸含量比正常菌体提高15.84 mg/g。在大肠埃希菌中高效表达植物源高赖氨酸蛋白基因,为该基因在益生菌中表达提供研究工作基础。