PALM成像中激光强度和定位精度相关性的研究

近十年来,基于单分子定位的PALM成像技术快速发展,将显微镜的分辨率提高到了2-25nm。本文发现PALM成像过程中采用的激发光强度与成像的定位精度之间有密切的联系。我们分别选择了PALM成像使用的光激活荧光蛋白、光转换荧光蛋白和光开关荧光蛋白中最常用的荧光蛋白进行验证。实验发现伴随激光强度的增加,大部分荧光蛋白的光子数先升高然后趋于饱和,背景噪声几乎线性升高。进一步分析发现荧光蛋白的定位误差随着激光强度增强先降低后升高,因此选用合适的激光强度在PALM成像实验中至关重要。如何提高PALM成像的分辨率一直是科学家研究的热点,本研究内容可以指导研究人员在PALM成像中选用合适的激发光强度,从而得到高分辨率的图像。     

Tet-On3G系统调控人巨细胞病毒蛋白pUL23稳定表达的人胚肺成纤维细胞(HELF)系的建立

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)为疱疹病毒家族一员,易导致免疫力低下或缺陷的人群严重疾病,目前对HCMV编码的皮层蛋白pUL23功能的相关报道很少。本研究应用Tet-On3G诱导表达系统,在人胚肺成纤维细胞(Human embryonic lung fibroblast,HELF)建立诱导表达HCMV病毒蛋白pUL23细胞模型。将病毒基因UL23和阳性对照基因EGFP分别定向插入应答慢病毒载体pLVX-TRE3G中,获得pLVX-TRE3GUL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP重组慢病毒载体。运用二代慢病毒包装系统与Lenti-X293T包装细胞系,制备收获慢病毒后感染人胚肺成纤维细胞HELF。遗传霉素(Geneticin,G418)和嘌呤霉素(Puromycin,Puro)抗性筛选后多西环素(Doxycycline,Dox)诱导外源基因表达。感染后的细胞在96孔板有限稀释法成单克隆,分别采用RT-PCR与Western blot技术检测病毒UL23基因在mRNA水平与蛋白水平的表达量,筛选出当诱导时高效表达且未诱导时低表达的单克隆细胞;并评估Dox诱导剂量与诱导时间对外源蛋白pUL23表达的影响。限制性内切酶与测序显示重组质粒pLVX-TRE3G-UL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP序列和方向正确。病毒蛋白pUL23在感染细胞中能够被诱导表达;当Dox浓度高于400ng/mL时pUL23蛋白表达量不再随Dox剂量增高而增高。在Dox诱导2h后,RT-PCR结果表明在921bp处有特定条带(UL23-3×Flag基因)与此同时,Western blot实验也检测到pUL23蛋白。这些结果表明,成功构建重组慢病毒载体,包装成慢病毒感染后,病毒基因UL23能够在人胚肺成纤维细胞中诱导表达。Dox的最佳工作浓度为400ng/mL,最佳诱导时间为12h至24h之间。这将为进一步研究病毒蛋白pU23的功能奠定基础。     

不同有机氮效率的甜菜基因型筛选及差异分析

通过对不同基因型甜菜土壤有机氮利用及吸收效率的筛选和差异分析,为土壤有机氮高效基因型甜菜的栽培及品种选育提供理论依据。2014-2015年选取100份不同基因型的甜菜材料通过室内及田间试验在甜菜的不同发育阶段比较并分析土壤有机氮效率,筛选出对有机氮利用及吸收效率均显著差异的高效和低效基因型甜菜材料。结果表明,初步筛选得到的有机氮高效基因型甜菜材料KWS8138、HI0466和有机氮低效基因型甜菜材料BETA176、T230苗期全株及根部有机氮利用效率（Organic Nitrogen Use Efficiency,ONUE）差异显著;之后通过田间试验对有机氮吸收效率（Organic Nitrogen Assimilation Efficiency,ONAE）做了进一步筛选,发现KWS8138不但对ONUE有显著优势,还具有较高的有机氮素吸收能力,包括苗期之后对土壤有机氮素的运转量较高,合理的根冠比等。有机氮低效基因型甜菜材料BETA176的有机氮素吸收利用能力很弱、氮素转运能力过低等限制了植株对有机氮素的合理利用,不利于有机氮效率的提高。因此确定KWS8138为有机氮高效基因型材料,BETA176为有机氮低效基因型材料,均可作为进一步试验的材料。有机氮高效基因型甜菜较高的土壤有机氮转运量及合理的根冠比促进了其对有机氮素的吸收,是有机氮高效的基础。较高的干物质生产效率反应了甜菜对有机氮素的高效利用,是有机氮高效的关键。     

莲品种DNA指纹图谱的构建

为了克服单纯依据形态特性鉴定品种的局限性, 我们开展了莲品种DNA指纹图谱构建研究, 旨在对其品种的快速准确鉴定及专利权保护等起一定作用。本研究以圆明园保存的72个莲品种为实验材料, 用来自不同地点的1,409份野生莲(Nelumbo nucifera)和58份美洲黄莲(N. lutea)群体样本作遗传背景参照。从104对核微卫星引物(nSSR)中筛选出15对, 从17对叶绿体微卫星(cpSSR)引物中筛选出2对, 共17对引物作为72个莲品种DNA指纹鉴定的条码。15对nSSR引物共检测到94个等位基因(平均6.27个), 其中11个属于美洲黄莲, 65个属于野生莲, 18个不能区分; 多态信息含量(PIC)介于0.3899-0.8023之间 (平均0.5748)。2对cpSSR引物共检测到13个单倍型, 其中9个属于野生莲, 4个属于美洲黄莲。全部17对引物标记结果显示, 共有19个品种含有美洲黄莲遗传组分, 其中8个母系来源于美洲黄莲; 有36个品种(涉及12对引物)具有至少1个特有基因型; 最少8对引物组合可完全区分开68个品种。有2组共4个品种组内全部17对引物均不能区分。本研究通过核心引物组合法使68个莲品种获得特异性DNA指纹。推荐13对nSSR和2对cpSSR共15对引物作为莲品种鉴定的核心条码, 并建议将形态特征与DNA指纹相结合作为莲品种的鉴定标准。     

生物质炭与氮肥配施对红壤线虫群落的影响

利用生物质炭改良土壤近年来受到关注,但仍缺乏对土壤动物群落变化的认识.基于野外定位试验,研究了不同用量的生物质炭(0、10、20、30、40 t·hm^-2)与氮肥(60、90、120 kg N·hm^-2)配施对干旱期和湿润期红壤理化性质和线虫群落的影响.结果表明： 施用生物质炭在干旱期和湿润期均显著影响土壤含水量和pH.随生物质炭施用量的增加,土壤含水量先增加后降低,而土壤pH保持增加的趋势.土壤微生物生物量碳氮、碳氮比及基础呼吸均受到生物质炭和氮肥的显著影响,且低量生物质炭对微生物生物量碳氮、碳氮比及基础呼吸有刺激作用,而高量生物质炭则对其有抑制作用.如生物质炭施用量低于30 t·hm^-2时,在干旱期和湿润期均促进土壤微生物活性.此外,生物质炭的效果也依赖于不同采样时期.如在施用量高于30 t·hm^-2时,微生物生物量碳在干旱期显著高于对照,在湿润期与对照无显著差异;而微生物生物量氮则呈相反趋势.可溶性有机物和矿质氮在干旱期受到生物质炭和氮肥的显著影响,但是在湿润期仅受到氮肥的影响.生物质炭、氮肥及二者的交互作用在干旱期和湿润期均显著影响线虫数量及营养类群的结构.高量生物质炭和氮肥配施能够提高土壤线虫的数量.值得注意的是,生物质炭显著提高了干旱期食真菌线虫的比例,尤其在干旱期趋势明显,暗示在生物质炭作用下土壤食物网结构趋向于以真菌主导的能流通道.总之,生物质炭对红壤的效果呈现出复杂的影响趋势,不仅依赖于生物质炭的施用量及与氮肥的交互作用,而且与红壤的采样时期有关,表明今后生物质炭的研究应结合多种生态因子.     

rhIL-12二硫键、N-糖基化位点及C端氨基酸序列分析

重组人白细胞介素12（rhIL-12）是一种已经用于治疗肿瘤,寄生虫、病毒性感染及造血障碍等疾病研究的异二聚体糖蛋白。结构确证是质量控制的重要内容,此研究对CHO细胞表达的rhIL-12二硫键配对方式、N-糖基化位点以及C端氨基酸序列进行了分析,使用Trypsin、Chymotrypsin和Glu-C三种酶分别对rhIL-12进行非还原酶解,尽可能地在其所有半胱氨酸残基之间断裂而形成二硫键相连的肽段,然后使用LC-MS/MS对酶解后的肽段样品进行分析,确定了rhIL-12样品中存在和理论配对方式相符的7对二硫键。将rhIL-12二硫键还原后并烷基化修饰保护,分别采用Trypsin,Chymotrypsin和GluC进行酶解,并用LC-MS/MS对酶解后肽段进行了质谱肽图及C端氨基酸序列分析,确定了rhIL-12 p35亚基C端氨基酸序列的8个氨基酸、p40亚基C端氨基酸序列的15个氨基酸。对rhIL-12样品还原及烷基化后用Trypsin变性酶解,所得肽段在H₂O及H₂¹⁸O水中分别用PNGase F糖苷酶处理酶切产物。并通过二级质谱分析脱糖后糖肽段分子量变化,从而确定了rhIL-12的3个N糖基化修饰位点,分别为p35亚基的71位和85位以及p40亚基的200位。通过建立酶解结合二级质谱鉴定的方法,证明了新药rhIL-12的二硫键位点、C端氨基酸序列和糖基化位点与理论一致。     

牦牛卵泡细胞及其卵母细胞不同发育时期的结构变化

采集成年母牦牛卵巢,通过光镜和电镜对牦牛卵泡及其卵母细胞不同发育时期的结构变化进行了观察。结果发现当卵母细胞被单层立方卵泡细胞包围时,微绒毛开始出现,而皮质颗粒、透明带则在包被2-4层卵泡细胞时开始出现。随着卵母细胞的继续发育,透明带增厚,微绒毛由粗短变为细长,密度增加;皮质颗粒、线粒体、滑面内质网等细胞器的数目不断增加,并逐渐移行到质膜下;在移行的过程中,皮质颗粒成团存在。在囊状卵泡中,卵母细胞皮质颗粒呈线形分布于质膜下,线粒体、滑面内质网又移向胞质中央。卵母细胞借助微绒毛穿过透明带与卵泡细胞胞质突起相联系。结果证明牦牛卵泡和卵母细胞不同发育时期的结构变化与其它哺乳动物的基本相似。     

凯特杏花粉的离体培养及影响因子分析

采用离体培养法,在不同培养基组分含量、pH值、温度及植物生长调节物质的培养条件下,对凯特杏(Prunus armeniacaL.cv Katy)花粉的离体萌发和花粉管生长状况进行观察研究。结果表明:(1)凯特杏花粉离体萌发及花粉管生长的适宜培养基为20%蔗糖 0.04%硼酸 0.01?Cl2,最适pH为6.0,最适温度为20℃,培养20 h后,花粉的萌发率达68.76%,花粉管长度达1 083.53μm。(2)不同植物生长调节物质对花粉萌发和花粉管生长作用不同,赤霉素浓度为5~8 mg/L、矮壮素浓度为10~150 mg/L、多效唑浓度为5~10 mg/L时对凯特杏花粉萌发和花粉管生长都有促进作用,但国光丁酰肼对凯特杏花粉萌发和花粉管生长均有抑制作用。     

人参皂甙对气虚型血管损伤中COX-2和iNOS相互作用的影响

探讨气虚型大鼠血管内皮损伤中COX-2和iNOS的蛋白水平及其相互作用,以及人参皂甙的防治作用.用高L-蛋氨酸复制SD大鼠血管内皮损伤,并附以负重游泳法制造气虚实验模型.应用Western blotting分析内皮损伤相关的COX-2和iNOS蛋白水平的变化,免疫共沉淀和激光共聚焦显微镜技术,探讨两者的相互作用,光镜和电镜分析血管内皮的病理变化.结果显示:模型组、COX-2和iNOS蛋白含量显著增高,并存在明显的相互作用,与血管内皮的病理损伤相一致;与模型组相比,人参皂甙组COX-2和iNOS的蛋白含量降低,且两者的相互作用减弱.气虚型大鼠血管内皮损伤中,COX-2和iNOS蛋白含量增高,且两者之间的相互作用增强,加重血管内皮损伤,人参皂甙能够纠正这些异常,起到保护血管内皮免受损伤的作用.     

PCR-DGGE技术在农田土壤微生物多样性研究中的应用

变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)在微生物生态学领域有着广泛的应用。研究采用化学裂解法直接提取出不同农田土壤微生物基因组DNA,并以此基因组DNA为模板,选择特异性引物F357GC和R515对16S rRNA基因的V3区进行扩增,长约230bp的PCR产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)进行分离后,得到不同数目且分离效果较好的电泳条带。结果说明,DGGE能够对土壤样品中的不同微生物的16S rRNA基因的V3区的DNA扩增片断进行分离,为这些DNA片断的定性和鉴定提供了条件。与传统的平板培养方法相比,变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术能够更精确的反映出土壤微生物多样性,它是一种有效的微生物多样性研究技术。