Mg~（2＋）对线粒体H~＋－ATP酶的阿霉素敏感性的拮抗效应──H~＋－AT

用生物膜的拆离与重建技术,研究了Ｍｇ２＋对阿霉素（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ,ＡＤＭ）抑制猪心线粒体Ｈ＋－ＡＴＰ酶及其重建脂酶体（Ｌ·Ｈ＋－ＡＴＰ酶）活性的影响。用胆酸盐透析方法将Ｈ＋－ＡＴＰ酶在大豆磷脂脂质体上重建。实验结果表明,重建Ｈ＋－ＡＴＰ酶的ＡＤＭ的敏感性较仅纯化而未重建者明显增加,这提示ＡＤＭ的抑制作用依赖于磷脂。但是,在有Ｍｇ２＋（１ｍｍｏｌ／Ｌ）条件下重建的Ｈ＋－ＡＴＰ酶对ＡＤＭ的敏感性较无Ｍｇ２＋者却又显著降低,这提示Ｍｇ２＋对ＡＤＭ抑制线粒体Ｈ＋－ＡＴＰ酶的作用具有拮抗效应。Ｍｇ２＋的这种拮抗效应是与其在透析重建Ｈ＋－ＡＴＰ酶过程中诱导脂酶体的磷脂的物理状态的改变相关的。所得实验结果对于阐明ＡＤＭ抑制线粒体Ｈ＋－ＡＴＰ酶的作用机理与磷脂的相关性提供了较直接的实验证据。     

猪心线粒体Fo的纯化、重建及其质子转运功能

比较了猪心线粒体F_oF₁-ATPase膜部分F_o的四种纯化方法.结果表明,用NaBr从亚线粒体除去F_oF₁-ATPase的水溶性部分F₁-ATPase后,再以CHAPS增溶,并经蔗糖梯度离心,可获得高纯度的F_o.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表明,纯化的F_o含有b、OSCP（寡霉素敏感授予蛋白）、d、a、e、F₆、IF₁、A6L和c等9种亚基.用去污剂稀释法将纯化的F_o在脂质体上重建后,重建F_o表现较高的被动转运质子活性.这为在体外深入研究F_o的活性、构象与膜脂的关系,以及F_o与F₁-ATPase的组装等提供了很好的实验模型.     

Stimulation and conformational change of Goa induced by GAP-43

GAP-43, a major component of the neuronal growth cone is closely correlated with neural development and regeneration[1—5]. Go is the predominant noncytoskeletal protein in the growth cone membrane[6]. It is a kind of heterotrimeric GTP-binding proteins, which transduce signals across the plasma membrane by coupling between receptors and effectors[7]. Stimulation or inhibi-tion of G proteins altered neurite outgrowth[3]. Mastoparan, which activates heterotrimeric G pro-teins of the Go and …     

一次成功的生物膜学术研讨会——第八次全国暨2003海内外生物膜学术研讨会

由中国生物物理学会、中国生物化学与分子生物学会、中国细胞生物学会、中国植物学会、国家自然科学基金委员会、生物大分子国家重点实验室、生物膜与膜工程国家重点实验室以及上海神经科学开放实验室等联合主办的“第八次全国暨 2 0 0 3海内外生物膜学术研讨会”于 2 0 0 3年 3月 2 5 - 2 8日在广西北海召开 .这是每三年一届的全国生物膜学术讨论会 .来自国内外高等院校 ,科研院所的 16 1位代表参加了这次讨论会 ,规模超过以往任何一届 .代表中有在国内外享有声誉的我国老一辈科学家 ,也有年富力强的中青年骨干 ,更令人振奋的是代表中半数…     

GAP-43对Goα的激活及其构象变化基础

GAP-43和Go是富含于神经生长锥的膜外周蛋白. 用碱抽提法从牛脑皮层获得了高纯度的GAP-43, 同时在大肠杆菌表达系统中获得了高纯度的豆蔻酰化Goα. 测定GAP-43对Goa结合³⁵S-GTPγS活力影响的结果表明, GAP-43可显著促进GAP-43对Goα的GTPgS的结合活力, 且呈浓度依赖性. 用CaM-Sepharose亲和柱的实验结果表明GAP-43与GAP-43对Goα·GDP之间存在直接的相互作用. 这种相互作用所引起的Goα的构象变化的测定结果显示, GAP-43使Goα·GDP的色氨酸内源荧光发射谱谱峰蓝移4 nm, 其荧光强度增高35.3%, 并使其HB的猝灭效率明显增加, 其表观猝灭常数(Ksv)由(1.1±0.22)×10⁵增至(4.1±0.43)×10⁵ M^-1. 而GAP-43对GAP-43对Goα·GTPγS无明显影响, 表明GAP-43直接作用于GAP-43对Goα·GDP引起其构象变化, 从而加速GDP的解离和GTPγS的结合, 导致Goα的激活并启动G蛋白的循环实现信号的跨膜转导和放大. 研究结果对阐明信号转导介导分子G蛋白在偶联受体和效应器之间的作用机理提供了有力的实验证据, 对进一步深入揭示GDP和GTP的交换方式在G蛋白的循环中的关键作用提供了新的启示.     

Stimulation and conformational change of G<Subscript>o</Subscript>α induced by GAP-43

GAP-43 and G_o are peripheral membrane proteins enriched in neuronal growth cone. GAP-43 was highly purified from bovine cerebral cortex and myristoylated G_oα was highly purified from Escherichia coli cotransformed with pQE60 G_oα and pBB131 (NMT). GAP-43 stimulated GTPγS binding to G_oα and the stimulation effect was dependent on concentration of GAP-43. Protein-protein binding experiments using CaM-Sepharose affinity media revealed that G_oα GDP bound GAP-43 directly to form intermolecular complex. This interaction induced conformational change of G_oα. In the presence of GAP-43, fluorescence spectrum of G_oα GDP blue shifted 4 nm; fluorescence intensity increased 35.3% and apparent quenching constant (Ksv) increased from (1.1 ±0.22) ×10⁵ to (4.1±0.43) × 10⁵ (M⁻¹). However, no obvious changes of fluorescence spectra of G_oα GTPγS were observed in the absence or presence of GAP-43. Our results indicated that GAP-43 induced conformational change of G_oα GDP so as to accelerate GDP release and subsequent GTPγS binding, which activates G proteins to trigger signal transduction and amplification. These results provided insights into understanding the function of G proteins in coupling between receptors and effectors and the key role of GDP/GTP exchange mode in GTPase cycle.     

利用流式细胞术检测线粒体PTP开放

用线粒体电位特异必 光探针Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３标记线粒休后,在改装ＦＡＣＳ４２０流式细胞仪上用Ｃ－３０数据集集和储存程序采集并存储数据,用Ｃ－３０分析程序分析得取反映线料体前散射（ＦＳＣ）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３荧光强度和侧散射（ＳＳＣ） ＦＳＣ,ＦＬ１和ＦＬ２合并图。结果显示,２００μｍｏｌ／ＬＣａ＾２＋处理２０分钟使线粒体同时发生ＦＳＣ增大、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３荧光强度降低和ＳＳＣ增     

Mg~（2＋）促进线粒体H~＋－ATP酶的重建机理──H~＋－ATP酶复合体亚基水平的研究

用专一性标记蛋白质巯基（－ＳＨ）的荧光探剂ａｃｒｙｌｏｄａｎ测定含Ｍｇ２＋的Ｆ０－ＡＴＰ酶或Ｆ０－ＯＳＣＰ－Ｆ１－ＡＴＰ酶的脂酶体的构象与无Ｍｇ２＋者明显不同,前者的蛋白质的－ＳＨ基团处于疏水性更强的微环境中;在有Ｍｇ２＋和ＯＳＣＰ同时存在下重建的Ｆ０－Ｆ１－ＡＴＰ酶脂酶体较无ＯＳＣＰ者表现更高的水解活力或膜电位,表明ＯＳＣＰ增强Ｍｇ２＋的促进作用,这进一步提示Ｍｇ２＋通过改变膜脂的物理状态促进线粒体Ｈ＋－ＡＴＰ酶重建的间接作用。这些实验结果,从线粒体Ｈ＋－ＡＴＰ酶复合体的亚基水平的相关性上,对于我们提出的Ｍｇ２＋通过改变膜脂的物理状态使之具有合适的流动性,诱导嵌入脂双层的Ｈ＋－ＡＴＰ酶复合体的Ｆ０的构象发生变化并传递至复合体的催化中心Ｆ１,从而使重建Ｆ１－Ｆ０－ＡＴＰ酶具有较适合的蛋白构象,表现较高的重建酶活性的假设提供了直接的实验证据,精确地阐明了Ｍｇ２＋促进线粒体Ｆ０－Ｆ１－ＡＴＰ酶重建作用的分子机理。     

肺腺癌A549/DDP细胞周期变化及其多药耐药性

用Fura 2 /AM标记药物敏感的肺腺癌细胞A54 9和抗顺铂药物的肺腺癌细胞A54 9/DDP两种细胞胞内游离Ca2 ,用碘化丙锭 (PI)标记细胞DNA ,检测其胞内Ca2 的变化及两种细胞增殖能力和细胞周期 .实验结果表明 ,抗药性细胞株A54 9/DDP胞浆内游离Ca2 的浓度仅为药物敏感细胞株A54 9的 1/ 3左右 ,同时前者的细胞增殖能力较后者明显增强 ,而且细胞周期也明显缩短 .当用BAPTA AM和EGTA或A2 3187和Thapsigargin处理细胞以降低或升高其胞内自由Ca2 浓度时可改变细胞的生长周期 ,二者也呈现明显差别 .这些结果表明 ,对顺铂产生耐药性的人肺腺癌A54 9/DDP细胞胞内Ca2 浓度的降低 ,可能影响细胞的增殖 ,缩短细胞的生长周期 ,特别是影响起决定作用的G1期 ,从而有利于肿瘤细胞多药耐药特性的维持