梯棱羊肚菌AA1_2家族多铜氧化酶基因的异源表达与生化鉴定

典型的漆酶通常属于辅助活性酶第一家族第一亚族（auxiliary activity family 1 subfamily 1,简称AA1_1家族）,而AA1_2家族的多铜氧化酶通常拥有将二价铁氧化成三价铁的活性,部分AA1_2家族酶蛋白兼具漆酶活性。梯棱羊肚菌全基因组只有一个AA1_2家族酶基因,该基因编码的酶蛋白是否拥有漆酶功能尚未清楚。本研究主要从酶生化特性的角度,结合酶基因的表达规律,对该基因的功能进行初探。对该AA1_2家族基因在梯棱羊肚菌生长发育不同阶段的表达水平进行实时定量PCR检测;将该基因编码序列克隆到表达载体中在大肠杆菌中异源表达,层析获得纯化的酶蛋白,对酶蛋白的生化特性进行了鉴定。发现该AA1_2多铜氧化酶基因在外源营养袋和土壤中的营养菌丝里低表达,在菇原基和子实体中表达较活跃。异源表达获得纯化的酶蛋白分子量约64kDa,表现出亚铁氧化酶（EC 1.16.3.1）与漆酶（EC 1.10.3.2）双重活性。其亚铁氧化酶活性在pH 4最高,漆酶活性在pH 6最高。亚铁氧化酶活性与漆酶活性的最适温度均为30℃左右,在30℃温育16h后仍保留70%以上活性。亚铁氧化酶和漆酶活性受Mn ²⁺、Hg ²⁺和Pb ²⁺抑制。对蛋白质变性剂SDS、尿素的耐受性较强。本研究通过酶学证据证实了梯棱羊肚菌AA1_2家族多铜氧化酶基因编码的酶蛋白具有亚铁氧化酶-漆酶双重活性,系在子囊菌大型真菌中首次发现,为进一步研究铁元素代谢与漆酶活性在羊肚菌子实体形成与发育过程中的作用提供了启示。     

躯体感觉Ⅱ区皮层内微刺激对猕猴回避性操作式条件反射和针刺镇痛的影响

在七只清醒、可以活动的猕猴上观察了皮层内刺激 S_Ⅱ区对外周痛阈和针刺镇痛的影响,其结果如下:(1)在73次皮层内刺激的实验中有72次引起对侧相应皮肤感受野的痛阈变化,其中54次痛阈明显升高。痛阈升高的效应在停止刺激后常持续0.5—3min。较浅层的刺激,痛阈升高比较明显;不同刺激强度引起的痛阈升高的程度也不相同。(2)一般皮层内刺激 S_Ⅱ区也可导致同侧相应皮肤感受野痛阈升高,但不如对侧痛阈升高明显。(3)皮层内刺激 S_Ⅱ区时,非感受野痛阈几乎没有任何改变。(4)S_Ⅱ区皮层内刺激可增强针刺镇痛效应。     

皮层内刺激或冷冻阻滞体感Ⅰ区对猴的操作式条件反射和针刺镇痛作用的影响

为了研究皮层体感Ⅰ区(S_Ⅰ 区)在痛觉的产生和调制以及在针刺镇痛中的作用,以皮肤伤害性刺激引起的操作式条件反射为痛指标,用钨丝微电极记录神经元的电活动和进行皮层内刺激,并用冰盐水进行皮层局部阻滞,在10只清醒的、可以活动的猕猴上进行了实验观察。刺激皮层 S_Ⅰ 区对感受野部位皮肤痛阈可产生明显的影响。在51次实验中有46次引起了痛阈的变化,仅有5次未见明显的变化。在13次对非感受野的皮肤痛阈的影响的实验中,10次未见变化,仅有3次出现轻度变化。皮层内刺激效应往往在刺激开始就出现,并延续到刺激的全过程。停止刺激后痛阈的恢复约需4—6分钟。皮层内刺激对针刺镇痛效应的影响与其对皮肤痛阈的影响有极为密切的关系,即皮层内刺激使皮肤痛阈下降者往往是对抗针刺的镇痛效应,而使皮肤痛阈升高者往往是加强针刺的镇痛效应。在12次冷冻皮层 S_Ⅰ 区的实验中全部都表现为使感受野皮肤痛阈的升高。去冷冻后约需3—8分钟才由抑制状态回复到原来水平。而对非感受野皮肤痛阈影响的8次实验中,有6次没有产生任何影响。本实验的结果表明,皮层体感区对痛觉是有一定的调制作用,当其受到电刺激或冷冻阻滞时,均可使相应部位的皮肤痛阈降低或升高,同时还能对抗或加强针刺的镇痛效应。