多孔微载体无血清培养rCHO细胞生产u-PA

在30L搅拌式反应器中无血清培养分泌尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)的DNA重组CHO细胞,定期部分更换Cytopore多孔微载体,使生长在多孔微载体中的细胞不断更新繁殖,解决大规模细胞培养中的细胞凋亡问题。在91d连接换液培养过程中,细胞密度可维持在(1.3～2.6)×107/mL,活细胞比率维持在90%以上。在7.5L搅拌罐中培养细胞,利用外部周期性压力振荡刺激并结合载体更新技术,可减轻密度效应对细胞生长和表达的影响,在一定程度上提高细胞在高密度培养条件下的表达水平。在67d连续换液培养中,细胞最高密度为2.64×10⁷/mL,活细胞比率维持在95%以上。与稳压操作相比,利用周期变压刺激技术可提高产量10%～20%,且可降低葡萄糖厌氧代谢生成乳酸的转化率,利用4步纯化工艺,从含u-PA约135g的2100 L上清中获得约80guPA(单链比例约为90%)。     

抗人肝癌单抗片段抗体HAb18F(ab′)2的冻干工艺研究

选择适合于HAb18 F(ab′)2片段抗体的冻干保护剂及其冻干工艺,是确保该生物制品的质量关键之一,对不同种类和不同浓度的保护剂进行了研究,结果表明10%蔗糖对HAb18 F(ab′)2片段抗体冻干样品的剂型、外观、残水量(＜3%)、复溶时间(＜10 s)、纯度(＞95%)及稳定性没有影响.研究优化与保护剂相结合的适用于HAb18 F(ab′)2片段抗体的最佳冻干工艺,为抗体片段扩大生产提供依据.     

重组人尿激酶型纤溶酶原激活剂的冻干及活性贮存时间估计

研究重组人尿激酶型纤溶酶原激活剂 ( u- PA)的冻干工艺 ,并对冻干产品的稳定性进行了观察。产品放置在 - 70℃和 4℃一年 ,活性和纯度未见明显变化。同时 ,通过在 80℃、70℃和 60℃的加速贮存试验 ( MIS) ,观察了 u- PA冻干产品的热稳定性 ,并对其活性的热降解速度和贮存寿命进行了估算。结果在 37℃、2 5℃、4℃和 0℃贮存时 ,活性单位损失 5 0 %所需时间分别为 1 73天、2 .78年、70 .8年和 1 1 8年 ;活性损失 1 0 %所需时间分别为 2 0天、1 0 0天、7.6年和 1 1年。说明 u- PA经冷冻干燥后保存 ,活性和纯度是稳定的     

重组人尿激酶原纯化中浓缩方法的比较

对尿激酶原纯化中的浓缩方法进行了探索,先后采用了3种不同的方法,即超滤、CM-阳离子柱、疏水色谱柱浓缩。结果表明,超滤只适合于大量样品的浓缩,样品量较小时损失较大,而且机械作用较强会使部分产品分解;CM-阳离子枉浓缩回收率较高,但得到的产品盐浓度高,还需要经过脱盐处理,增加了操作步骤,而疏水柱浓缩方法较为理想,经它浓缩后的产品用SDS-PAGE分析,非还原条件下,纯度在98％以上,还原条件下单链占90％以上,浓缩16倍,尿激酶原浓度达到3mg/ml以上。     

免疫亲和层析法纯化单链尿激酶型纤溶酶原激活剂

尿激酶原 (Ｐｒｏ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ,ｐｒｏ ＵＫ) ,也称单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ,ｓｃｕ ＰＡ) ,与ｔ ＰＡ一样是第二代溶栓药物。给药时 ,保持无活性的酶原状态 ,只激活被纤维蛋白吸附的纤溶酶原 ,而对游离的纤溶酶原没有作用 ,即只在血栓表面才能活化转变为双链尿激酶 (Ｔｗｏ ｃｈａｉｎｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ,ｔｃｕ ＰＡ或ＵＫ) ,因而具有较高的特异性溶血栓作用[1 ] 。尿激酶原…     

重组尿激酶原的纯化和性质研究

CHO工程细胞11G持续表达的pro-UK分泌在细胞培养液的上清中,培养液上清经过微孔玻璃(MPG)吸附色谱,羧甲基阳离子交换色谱,高压液相凝胶色谱三步纯化,纯化倍数可达700倍以上,总回收率为46％．再经过Benzamidine-Sepharose 6B亲和层析去掉少量的双链尿激酶,得到纯化尿激酶原．终产物经SDS-PAGE银染分析,纯度达90％以上,分子量为52 ku,其比活性为51 220 U/mg．抗体中和、二异丙基氟磷酸(DFP)抑制等实验证明重组pro-UK的性质和天然pro-UK的性质相一致．     

大豆疫霉和苜蓿疫霉rDNA ITS序列分析

采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物,PCR分别扩增了Phytophthora sojae的5个菌株(Pg1、Pg2、Pg3、CN1和S317)和1个P.medicaginis(菌株44390)的ITS1与ITS2,并对PCR产物进行了序列测定。根据Bioedit软件中的neighbour-joining methods分析法将上述序列和Genbank中已登录的P.sojae、P.medicaginis、P.megasperma和P．trifolii等4个形态学种10个登录菌株的ITS1与ITS2碱基序列进行聚类分析。结果是聚类组与形态学种有一定差别,4个种16个菌株分成7个聚类组。结果表明,分别属于同一形态学种且可聚为一组的不同个体之间的ITS碱基序列遗传相似性最高,但是也具有一定的多样性;形态学上属于不同种的个体的ITS可以聚为一组。上述结果提示L41385可能不属于P.sojae,L41380可能属于是P.trifolii,P.megasperma仍是一个复合种。同时提示ITS DNA碱基序列可以区分形态学种。     

刺桐属胰蛋白酶抑制剂的结构与生物活性关系

刺桐胰蛋白酶抑制剂（ETI）属于丝氨酸蛋白酶抑制剂,它能和胰蛋白酶及瑞替普酶（r-PA）等精氨酸特征性的丝氨酸蛋白酶发生了可逆亲合作用,根据此特性可将ETI作为固定配基制备成亲合填料,用于大规模高效分离r-PA,满足临床对溶栓制剂r-PA的大量需求,本对刺桐属胰蛋白酶抑制剂的结构与抑制活性关系进行综述。     

重组人尿激酶原冻干产品的稳定性

目的：探讨重组人尿激酶原（rhPro-UK）冻干产品的稳定性。方法：采用S-2444发色底物法测定贮存在4℃和-20℃的rhPro-UK冻干产品的活性、单链比例随时间的变化规律;用SDS-PAGE及RP-HPLC肽图分析贮存在-20℃的rhPro-UK冻干产品的结构与组成的变化。结果：4℃保存3年后的rhPro-UK冻干产品的总活性和单链比例基本没有变化,但随着贮存时间的延长,有部分产品降解,如贮存78个月的样品,总活性可降低13％～15％;-20℃保存78个月后,rhPro-UK冻干产品的总活性和单链比例未见明显变化。SDS-PAGE及RP-HPLC肽图图谱显示,-20℃贮存78个月后的rhPro-UK冻干产品的组成和结构没有变化。结论：rhPro-UK冻干产品在4℃的贮存寿命可达3年;长期贮存于-20℃的rhPro-UK冻干产品,其总活性、单链比例及结构组成非常稳定。     

小剂量重组组织纤溶酶原激活剂治疗急性心肌梗死临床研究概况

1990年代中期以来,国内130多家医院入组9378例急性心肌梗死患者,其中用小剂量（50mg）重组组织纤溶酶厚激活剂（rt-PA）治疗6693例,阻塞相关血管开通5318俐,开通率为79.46％;死亡293倒,病死率为4.38％;出血550俐,出血率勾8.22％,其中重度出血7例,颅内出血21例（0.31％）,再次梗塞60例（0.90％）。超过40家医院对rt-PA（50mg）与尿激酶治疗急性心肌梗死疗效进行了比较,共计入组3449倒急性心肌梗死患者,rt-PA治疗1689例,先静脉推注8mg,其余42mg在30或60和90min滴注;尿激酶治疗1760例,150万U位滴注30min。结果显示,阻塞相关冠脉血管开通率分别为79.40％（1341例）和5733％（1009例）,相差非常显著（P〈0.001）。12家医院研究了rt-PA50-9100mg治疗急性心肌梗死的效果,共计入组1054例患者,其中50mg组487例,100mg组567例,阻塞相关血管开通率分别为78.85％和82.36％。另有22家医院入组1017倒病人,行rt-PA50mg30rain给药临味试验,冠脉开通率达80.53％;18家医院行rt-PA50mg 60min给药临床试验,入组942例病人,阻塞相关血管开通率为77.92％;50家医院用rt-PA50mg 90min给药方案治疗急性心肌梗死患者,入组2768例患者,冠脉开通率为77.89％。6家医院对用rt-PA（50mg）与链激酶治疗急性心肌梗死的疗效进行了对比,结果表明相关血管开通率分别为81.4％和65.2％22家医院比较了小剂量rt-PA对急性心肌梗死患者症状发作不同时间的治疗效果,表明症状发作时间越短,用药的溶栓效果越好。刘光对入院前和入院后用小剂量rt-PA溶栓进行了比较研究,证明入院前溶栓比入院后效果好。对冠脉内输注rt-PA（50mg）和2次静脉推注小剂量rt-PA治疗急性心肌梗死的效果也进行了探索。